高效液相色譜分析(福建師范大學(xué))

第三章

高效液相色譜分析highperformanceliquidchromatograph2024/5/16教學(xué)目標及要求：1.掌握液相色譜的特點；2.掌握液相色譜法的分類；3.了解影響液相色譜峰擴展及色譜別離的因素；4.理解液相色譜別離的原理；5.了解液相色譜的固定相和流動相；6.了解液相色譜儀的組成和結(jié)構(gòu)原理及主要部件；7.了解液相色譜別離類型的選擇；8.了解液相色譜的應(yīng)用。教學(xué)重點、教學(xué)難點：1.高效液相色譜與氣相色譜的異同點

2.高效液相色譜速率理論方程式在實驗條件優(yōu)化中的應(yīng)用

3.別離柱和流動相的選擇和匹配

4.不同種類液相色譜別離的原理上的差異2024/5/16第一節(jié)

高效液相色譜法概述Generalizationofhighperformanceliquidchromatograph一、概述Generalization二、高效液相色譜儀HPLC三、高效液相色譜法的特點featureofHPLC四、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC2024/5/16高效液相色譜法：以液體作為流動相的色譜法。它是在經(jīng)典液相色譜實驗根底上，引入氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用高壓輸液泵，高效固定相和高靈敏的檢測器，而開展起來的快速別離分析技術(shù)。具有別離效能高，檢出限低，操作自動化和應(yīng)用范圍廣的特點。一、概述Generalization2024/5/16(一)、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜

常壓或減壓

填料顆粒大

柱效低

分析速度慢

色譜柱只用一次不能在線檢測

高壓，40～50MPa

填料顆粒小，2～50μm

柱效高,40000～60000塊/m

分析速度快

色譜柱可重復(fù)多次使用

能在線檢測2024/5/16(二)、HPLC與GC異同點氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析用毛細管色譜可得到很高的柱效有很靈敏的檢測器如ECD和較靈敏的通用檢測器（FID和TCD）流動相為氣體，無毒，易于處理運行和操作容易儀器制造難度較小幾乎可以分析各種物質(zhì)

可以用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析色譜柱不能很長，柱效不會很高沒有較高靈敏的通用檢測器①

流動相有毒，費用較高運行和操作比GC難一些儀器制造難度大①近來出現(xiàn)的蒸發(fā)激光光散射檢測器〔ELSD〕是靈敏度較高的通用檢測器2024/5/16流動相差異GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用。HPLC：流動相為液體組分與流動相和固定間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善別離度增加了因素，對別離起很大作用。流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對別離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大別離選擇性操作條件差異GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓〔液體粘度大，峰展寬小〕2024/5/16二、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph2003年全球液相色譜市場的總銷售額為25.16億美金，2021年預(yù)計將到達33.83億美金。國內(nèi)對液相色譜儀的需求量越來越大：2000年版中國藥典規(guī)定用液相色譜儀對藥物的最終質(zhì)量控制和檢驗，較之95版藥典有了大幅度的增加；我國的醫(yī)藥生產(chǎn)、新藥開發(fā)以及中草藥的研究都大大增加了對液相色譜的需求；色譜分析已被列為全國化學(xué)及相關(guān)專業(yè)大學(xué)生的必修課，全國近1000所大學(xué)學(xué)生實驗用液相色譜儀的需求量將相當可觀；隨著國家對環(huán)境保護和生態(tài)平衡的更加重視，“十五〞期間全國各地的環(huán)境監(jiān)測站也已逐步配備液相色譜儀及其他分析儀器，對水質(zhì)、大氣和土壤進行監(jiān)控；我國進出口國際貿(mào)易近年來快速增長，并還將持續(xù)大幅度增長，而色譜分析方法及其色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是世界公認的商品檢驗手段之一，只有高質(zhì)量的色譜儀、色質(zhì)聯(lián)用儀和高水平的檢驗結(jié)果才可能被世界各國認可，沒有足夠數(shù)量的高質(zhì)量色譜儀器和色質(zhì)聯(lián)用儀就難以“與世界接軌〞。我國液相色譜儀的開展遠遠落后于氣相色譜儀的開展，目前國內(nèi)使用的液相色譜儀90%以上均是進口產(chǎn)品?！?004年市場調(diào)查報告2024/5/16液相色譜儀〔1〕2024/5/16液相色譜儀〔2〕2024/5/16液相色譜儀〔3〕2024/5/16液相色譜儀〔4〕2024/5/16美.瓦里安

Prostar210高效液相色譜儀2024/5/16三、高效液相色譜法的特點和應(yīng)用特點：“三高〞“一快〞“一廣〞高柱效——n=104片/米，柱效高〔遠高于一般LC〕高靈敏度(紫外：10-9g；熒光：10-11g)高選擇性分析速度快(＜1h)應(yīng)用范圍廣泛〔可分析80%有機化合物〕〔是高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效別離分析方法。〕2024/5/16四、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程液相色譜流程圖PUMPDetectorWDatastation(Recorder)orCollection2024/5/162.主要部件P83(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相〔<10μm〕，液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕往復(fù)式柱塞泵死體積小，很適用于梯度洗提等特性。2024/5/16(2)梯度淋洗裝置外梯度:〔低壓梯度〕將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度：〔高壓梯度〕一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2024/5/162024/5/16(3)進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如下圖：裝入樣品出口進樣采樣環(huán)泵入溶劑進色譜柱2024/5/16(4)高效別離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。開展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2024/5/16理想的HPLC檢測器應(yīng)具有如下特性：

第一，具有高靈敏度和可預(yù)測的響應(yīng)；第二，對樣品所有組分都有響應(yīng)，或具有可預(yù)測的特異性，適用范圍廣；第三，溫度和洗脫液流速的變化對響應(yīng)沒有影響；第四，響應(yīng)與洗脫液組成無關(guān)，因此可作梯度洗脫；第五，死體積小，不造成柱外譜帶擴展；第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和檢修；第七，響應(yīng)值隨樣品組分量的增加而線性增加，線性范圍寬；第八，不破壞樣品組分；第九，能對被檢測的峰提供定性和定量信息；第十，響應(yīng)時間快。(5)液相色譜檢測器2024/5/16分類標準種類響應(yīng)原理特點常用類型按檢測

器性質(zhì)

或應(yīng)用

范圍分

類總體性能檢測器響應(yīng)值取決于流出物（包括樣品和流動相）某些物理性質(zhì)的總的變化的檢測器有廣泛的適用范圍，基線噪音和漂移較大，靈敏度低，不適于痕量分析，不能用于梯度洗脫示差折光率檢測器介電常數(shù)檢測器電導(dǎo)檢測器溶質(zhì)性能檢測器響應(yīng)值取決于流動相中溶質(zhì)的物理或化學(xué)特性的檢測器檢測靈敏度高，受操作條件和外界環(huán)境影響小，可用于梯度洗脫，應(yīng)用范圍受限制紫外-可見檢測器熒光檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器安培檢測器手性檢測器按測量

信號性

質(zhì)分濃度敏感性檢測器響應(yīng)值正比于溶質(zhì)在流動相中的濃度，測量的是流動相中溶質(zhì)濃度瞬間的變化樣品量一定時，檢測器瞬間響應(yīng)即峰高響應(yīng)值和流動相流速無關(guān)，峰面積與流速成反比，峰面積與流速乘積為常數(shù)大部分常用的液相色譜檢測器都屬于該類檢測器質(zhì)量敏感性檢測器響應(yīng)值正比于單位時間內(nèi)通過檢測器的物質(zhì)的質(zhì)量即正比于質(zhì)量流速峰面積與流動相流速無關(guān)，峰響應(yīng)值與流速成正比庫侖檢測器檢測器的分類：2024/5/16按

測

量

原

理

分光學(xué)性質(zhì)檢測器根據(jù)被測物質(zhì)對光的吸收、發(fā)射和散射等性質(zhì)進行檢測的應(yīng)用范圍廣，靈敏度高紫外-可見檢測器，示差折光率檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器，熒光檢測器，化學(xué)發(fā)光檢測器，手性檢測器電學(xué)及電化學(xué)性質(zhì)檢測器根據(jù)被測物電化學(xué)性質(zhì)進行檢測

安培檢測器，電導(dǎo)檢測器，庫侖檢測器，介電常數(shù)檢測器，極譜檢測器熱學(xué)性質(zhì)檢測器利用熱學(xué)原理進行檢測

光聲檢測器，熱透鏡和光熱偏轉(zhuǎn)檢測器按信號

記錄方

式分積分型檢測器顯示的信號是指在給定時間內(nèi)物質(zhì)通過檢測器的總量靈敏度低，定性困難，應(yīng)用少

微分型檢測器顯示的信號表示在給定時間內(nèi)每一瞬間時通過檢測器的量靈敏度高

2024/5/16a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大局部有機化合物有響應(yīng)。特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小〔1mm×10mm，容積8μL〕；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2024/5/16b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如下圖。2024/5/162024/5/16光電二極管陣列檢測器2024/5/16c.示差折光檢測器

〔differentialrefractiveindexdetector〕

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測器〔每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)〕；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干預(yù)型三種；2024/5/16示差折光檢測器2024/5/16d.熒光檢測器

〔fluorescencedetector〕高靈敏度、高選擇性的檢測器。對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；e.其它檢測器：

電化學(xué)檢測器(電導(dǎo)檢測器、伏安檢測器等)

電導(dǎo)檢測器直接測定柱后洗脫液的電導(dǎo)變化。將被測洗脫液置于施加電場的兩個電極間，電導(dǎo)值1／R〔R為兩電極間電阻值〕與電極截面積A，兩電極間距離L和各離子的電導(dǎo)總和∑Cⅰλⅰ之間有如下關(guān)系:

式中Cⅰ為i離子的摩爾濃度，λⅰ為i離子的摩爾電導(dǎo)。2024/5/16一、液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph三、離子交換色譜ion-exchangechromatograph四、離子色譜ionchromatograph五、離子對色譜ion-pairchromatograph六、排阻色譜size-exclusionchromatograph七、親和色譜(AC)Affinity

chromatograph第二節(jié)

主要別離類型與原理P70basicprincipleandmainseparatingtypes2024/5/16一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography固定相：固體吸附劑：如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑，“相似相溶〞原理根本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于別離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2024/5/16二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動相均為液體〔互不相溶〕；根本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性〔正相normalphase〕，別離極性化合物，極性小的先出峰。反之，流動相的極性大于固定液的極性〔反相reversephase〕。正相與反相的出峰順序相反。

aqorgii

KiStationaryphaseMobilephase2024/5/16固定相有機基團主要有三類：

1.疏水基團:如不同鏈長的烷烴〔C8，C18，C6等〕。

2.極性基團：如丙胺基，氰乙基，醚和醇等。

3.離子交換基團：如作為陰離子交換基團的胺基，季銨鹽。作為陽離子交換基團的磺酸基等。固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：〔將各種不同基團通過化學(xué)反響鍵合到硅膠〔擔體〕外表的游離羥基上)。2024/5/16三、離子交換色譜

ion-exchange

chromatography鍵合相離子交換劑是以硅膠為基質(zhì)，在它上面覆蓋一層如下圖的離子交換樹脂涂層，或者在硅膠上直接鍵合離子交換基團。固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；2024/5/16流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；根本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反響；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保存時間長。陽離子交換：陰離子交換：離子交換反響到達平衡時，保存值決定于平衡常數(shù)。容量因子k’與平衡常數(shù)K成正比，且與流動相中的反離子濃度〔M+、X-〕成反比。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等。2024/5/16四、離子色譜P74

ionchromatography

離子交換色譜法由于沒有與之相匹配的檢測器，難以發(fā)揮更大的作用。無機離子與大多數(shù)有機離子不同，只有在遠紫外區(qū)才有吸收，光度檢測器不適于檢測無機離子，而電導(dǎo)檢測器卻是可檢測電解質(zhì)溶液的通用型檢測器，這種檢測器簡單易于操作，但是長時間以來沒有一種可以和電導(dǎo)檢測器相適應(yīng)的別離模式。直到1975年Small才提出把電導(dǎo)檢測器用于離子交換色譜，他為了克服洗脫液中的離子對電導(dǎo)檢測器的干擾。在分析柱和檢測器之間增加一個“抑制柱〞，消除洗脫液中離子本身帶來的本底電導(dǎo)，他把這一方法叫做“離子色譜〞〔IonChromtatography〕。這一方法提出之后受到普遍的重視，20多年來得到了長足的開展，成為分析無機和有機離子十分重要的方法，在各領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。2024/5/16離子色譜儀2024/5/16離子色譜法原理

principleofIC(IonChromatography,簡稱IC)以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象,在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速開展。

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測方法。2024/5/16離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制〔在別離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)〕；可采用電導(dǎo)檢測器，快速別離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，開展迅速。2024/5/16離子色譜具有以下優(yōu)點〔1〕分析速度快可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析；〔2〕別離能力高在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物別離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全別離。〔3〕別離混合陰離子的最有效方法〔4〕耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2024/5/16離子色譜裝置類型

suppressedapparatusofIC抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型別離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹脂。用NaOH洗脫，但高電導(dǎo)背景，靈敏度差增加抑制柱解決解決方法？2024/5/16抑制柱為高容量的強酸性陽離子交換劑。當試樣經(jīng)陰離子交換劑的別離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反響：由反響可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量堿轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陰離子OH-轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸，由于H+離子的淌度為Na+離子的7倍，提高了所測陰離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。淌度：在單位電場強度下,某種離子i在一定溫度和一定介質(zhì)中移動的速率2024/5/16離子色譜連續(xù)抑制裝置圖2024/5/16假設(shè)樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的別離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反響：由反響可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。2024/5/16在別離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了別離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。為了提高信噪比，洗脫液必須要用低電導(dǎo)物質(zhì)，而且它的濃度要低，固定相的離子交換容量也降低，這樣可使被測離子的保存時間在合理的范圍之內(nèi)。2024/5/16離子色譜連續(xù)抑制原理圖非抑制型:當進一步降低別離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與別離柱相連，不需抑制柱。2024/5/16離子色譜的應(yīng)用

applicationofIC陰離子分析:雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂別離柱(3×250mm),流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)根本上得到完全別離，各組分含量在3～50ppm。2024/5/16五、離子對色譜

ionpairchromatography原理：將一種〔或多種〕與溶質(zhì)離子電荷相反的離子〔對離子或反離子〕加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；

圖離子對色譜別離過程示意圖2024/5/16陰離子別離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子別離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子B+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子A-進入流動相后，生成疏水性離子對B+A-后；在兩相間分配。根據(jù)離子對生成反響式，平衡常數(shù)KAB可表示為:根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù):得：2024/5/16六、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小別離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過局部凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量別離2024/5/16排阻色譜示意圖：M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16七、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某種特異性親和力，進行選擇性別離。先在載體外表鍵合上一種具有一般反響性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保存。改變淋洗液后洗脫2024/5/16一、液相色譜固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色譜流動相

mobilephaseofHPLC第四節(jié)

液相色譜的固定相與流動相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC2024/5/16一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC1.液-液分配及離子對色譜別離固定相〔1〕全多孔型擔體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，外表涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；〔2〕外表多孔型擔體〔薄殼型微珠擔體〕30～40μm的玻璃微球，外表附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。外表積小，柱容量低；2024/5/16〔3〕化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最正確的固定相。制備鍵合固定相一般有如下幾種途徑：1.用醇或胺與硅醇基反響，形成≡Si—O—C硅氧碳鍵型和硅氮≡Si—N—C鍵型.本法的缺點是產(chǎn)物容易水解和醇發(fā)生交換反響，因此僅適用已枯燥的無水乙醇為流動相。2.用有機氯硅烷與硅醇反響，形成≡Si—O—Si—C硅氧硅碳鍵型.本法的最大優(yōu)點是固定相的熱穩(wěn)定性好。不易吸水，耐有機溶劑。能在700C,pH=2-8正常工作，因此應(yīng)用特別廣泛。3.通過硅膠與鹵代烷反響，形成≡Si—C硅碳鍵型2024/5/16硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣

2024/5/16化學(xué)鍵合固定相的特點〔1〕傳質(zhì)快，外表無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；〔2〕壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；〔3〕穩(wěn)定性好，耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；〔4〕選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；〔5〕有利于梯度洗脫；存在著雙重別離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定別離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；〔封尾〕2024/5/162.液-固吸附別離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2024/5/163.離子交換色譜別離固定相結(jié)構(gòu)類別：〔1〕薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔體，外表涂約1%的離子交換樹脂；〔2〕離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型〔鍵合離子交換基團〕樹脂類別：〔1〕陽離子交換樹脂〔強酸性、弱酸性〕〔2〕陰離子交換樹脂〔強堿性、弱堿性〕2024/5/164.空間排阻別離固定相〔1〕軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻別離。〔2〕半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑〔3〕硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2024/5/16二、液相色譜的流動相

mobilephasesofLC1.流動相特性〔1〕液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分別離狀況；〔2〕親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱?！?〕假設(shè)流動相的極性大于固定液的極性，那么稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型別離柱上的出峰順序相反。2024/5/162.流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進別離或調(diào)整出峰時間。2024/5/163.流動相選擇在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配別離時：首先選擇中等極性溶劑，假設(shè)組分的保存時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保存時間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2024/5/164.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題〔1〕盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加?！?〕防止流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等?！?〕試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。〔4〕流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。選擇高效液相中溶劑的示意圖2024/5/16一、影響別離的因素factorsinfluencedseparation二、別離類型的選擇choiceofseparationtypes三、液相色譜的應(yīng)用applicationofHPLC四、液相制備色譜preparativeliquidchromatography第五節(jié)

影響別離的因素與操作條件的選擇

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition2024/5/16一、影響別離的因素

factorsinfluencedseparation影響別離的因素與提高柱效的途徑在高效液相色譜中,液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，那么速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，即：H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如下圖。2024/5/16

液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善別離的最直接的因素。2024/5/162.流速流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整別離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。3.固定相及別離柱氣相色譜中的固定液原那么上都可以用于液相色譜，其選用原那么與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，別離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。2024/5/16速率方程可簡化為：

Dm、Ds—試樣分子在流動相、固定液中的擴散系數(shù)

關(guān)鍵是將H變小，而H變小關(guān)鍵是使dp變小，df變小。因此采用3～5m固定相顆粒，且鍵合相層薄，因此df就小，由于H很小，n很多，R大改進，實現(xiàn)了高效。在別離良好的根底上，才可提高流動相線速，節(jié)省了分析時間，從而實現(xiàn)了高速別離。如何實現(xiàn)高速別離？2024/5/16影響色譜峰擴展的因素2024/5/16二、別離類型選擇

choiceofseparationtypes2024/5/16三、HPLC的應(yīng)用

applicationofHPLC

1.環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：差示折光檢測器2024/5/162.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2024/5/16四、制備型液相色譜

preparativeliquidchromatography獲得高純物質(zhì)〔色譜純〕的有效方法。半制備柱〔內(nèi)徑8mm，長度15～30cm〕，一次制備量０.1～１mg；1.色譜柱的柱容量〔柱負荷〕對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量；對制備柱：不影響收集物純度時的最大進樣量；超載：進樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。2024/5/162.液相制備色譜的方法收集組分時，通常有以下情況：〔1〕可獲得良好別離，主峰使用制備柱，超載提高效率；〔2〕兩主成分之間的小組分；超載，別離切分使待別離組分成為主成分〔富集〕后，再次別離制備。2024/5/163.制備型液相色譜

制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長50cm。2024/5/16一、超臨界流體色譜的特點與原理featureandprincipleofSFC二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程structureandgeneralprocessofSFC三、超臨界流體色譜的應(yīng)用applicationofSFC第七節(jié)

超臨界色譜supercriticalfluidchromatograph,SFC2024/5/16一、超臨界流體色譜的特點與原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1.概述超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速開展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點:〔1〕可處理高沸點、不揮發(fā)試樣；〔2〕比LC有更高的柱效和別離效率。2024/5/162.超臨界流體性質(zhì)〔1〕性質(zhì)介于液體和氣體之間;具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴散系數(shù)位于兩者之間?！?〕可通過改變超臨界流體的密度〔程序改變〕調(diào)節(jié)組分別離〔類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗〕。超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。2024/5/163.原理SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3SFC的固定相：固體吸附劑〔硅膠〕或鍵合到載體〔或毛細管壁〕上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細管柱SFC；別離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被別離；通過調(diào)節(jié)流動相的壓力〔調(diào)節(jié)流動相的密度〕，調(diào)整組分保存值；2024/5/16壓力效應(yīng)：SFC的柱壓降大〔比毛細管色譜大30倍〕，對別離有影響〔柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)〕；超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對別離的影響?。粔毫π?yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。CO2流動相，當壓力改變：7.0→9.0×106Pa，那么：C16H34的保存時間25min→5min。2024/5/16程

序

升

壓2024/5/16HPLC與SFC

比較2024/5/16二、超臨界流體色譜的結(jié)構(gòu)與流程

instrument

structureandthegeneralprocessofSFC1.結(jié)構(gòu)流程

2024/5/162.主要部件〔1〕SFC的高壓泵無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量；〔2〕SFC的色譜柱和固定相可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細管柱；SFC的固定相：固體吸附劑〔硅膠〕或鍵合到載體〔或毛細管壁〕上的高聚物；專用的毛細管柱SFC；2024/5/16主要部件〔3〕流動相SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點：極性太弱；加少量甲醇等改性；〔4〕檢測器可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器2024/5/16三、超臨界流體色譜的應(yīng)用

applicationofSFC1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m×63μmi.d.

毛細管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動相：CO2；柱溫：120

C；程序升壓；2024/5/162.甘油三酸酯的分析四種組分僅雙鍵數(shù)目和位置不同，難別離；色譜柱：DB-225SFC毛細管柱；流動相：CO2；從15MPa程序升壓到27MPa；2.5hr完全別離。2024/5/16第七節(jié)毛細管電泳

〔Capillaryelectrophoresis，CE〕一、概述在外加電場的作用下，帶電的膠體粒子或離子在分散的介質(zhì)中作定向移動〔泳動〕的現(xiàn)象稱為電泳。不同帶電粒子由于荷電量不同，分子的大小不同，泳動的速度也就不同，因此、電泳是一種適合于帶電膠體粒子和離子的別離分析技術(shù)。電泳現(xiàn)象：帶電離子在電場作用下的遷移，速度電滲流現(xiàn)象：玻璃外表存在硅羥基,pH＞3時,形成雙電層，在高電場的作用下引起柱中的溶液整體向負極移動，速度。2024/5/16別離過程

電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反，時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。2024/5/16高效毛細管電泳儀器〔1〕2024/5/16高效毛細管電泳儀器〔2〕2024/5/16高效毛細管電泳儀器〔3〕2024/5/16三維毛細管電泳系統(tǒng)〔AgilentCE，美國Agilent公司〕高效毛細管電泳儀器〔4〕2024/5/16特點：使用散熱效率很高的毛細管〔25~50μm〕可以減少電泳時產(chǎn)生的焦耳熱而導(dǎo)致的區(qū)域展寬，因而可以采用較高的電壓〔20~30kV〕，有利于獲得很高的別離效率，每米塔板數(shù)可達幾十萬，高者可達106，分析時間一般小于30min，試樣分析范圍寬，檢測限低。進樣量少，可達nl級，極微量的成分也可檢出，且樣品無需進行復(fù)雜的前處理，就可別離分析。高分辨率：理論塔板數(shù)高達數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)別離30種陰離子；1.7分鐘別離19種陽離子；4分鐘可別離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL〔10-9L〕的試樣儀器簡單，操作本錢低：分析一個試樣僅需幾毫升流動液。2024/5/16應(yīng)用范圍：

在中、西藥物等分析領(lǐng)域廣泛地被應(yīng)用，同時也廣泛地向生命科學(xué)領(lǐng)域的各個方面滲透，大量用于氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、低聚核苷的別離，對糖蛋白、糖肽型化合物的研究也正在進行之中。其中生物堿、有機酸等所有帶電或不帶電的化合物均可進行定量檢測,蛋白質(zhì)、糖肽、糖蛋白那么可得到很好的別離分析。2024/5/16二、構(gòu)造

主要包括高壓電源、毛細管、檢測器和貯液槽四個局部。2024/5/16三、CE的別離模式1、毛細管區(qū)帶電泳〔capillaryzoneelectrophoresisCZE〕2、毛細管凝膠電泳〔capillarygelelectrophoresisCGE〕3、膠束電動力學(xué)毛細管電泳〔micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC或MEKC〕4、毛細管等電聚焦〔capillaryisoelectricfocusingCIEF〕5、毛細管等速電泳〔capillaryisotachoporesis，CITP〕6、毛細管電滲色譜〔capillaryelectroosmoticchromatography，CEC)種類較多，實際應(yīng)用不多，多用于科學(xué)研究——主要原因重現(xiàn)性不高2024/5/162024/5/16第八節(jié)薄層色譜法TLC〔一〕概述1．定義：將固定相均勻涂布在外表光滑的平板上，形成薄層而進行色譜別離和分析的方法2．操作過程：鋪板→活化→點樣→展開→定位(定性)/洗脫(定量)3．別離機制：吸附〔分配，離子交換，空間排阻〕4．特點：分析快速、靈敏、顯色方便5．應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定2024/5/162024/5/16〔二〕定性參數(shù)1.比移值RfRf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)〔溶解度〕以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜根本定性參數(shù)，說明組分的色譜保留行為。2024/5/161〕K↑大，Rf↓小2〕薄層板一定，對于極性組分展開劑極性↑大，Rf↑大〔容易洗脫〕展開劑極性↓小，Rf↓小〔不容易洗脫〕3〕Rf范圍：0<Rf<1〔組分遷移速度和距離小于展開劑遷移速度和距離〕Rf=0.2——0.8〔常用〕0.3——0.5〔最正確〕2024/5/16參考物與被測組分在完全相同條件下展開，可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后參加純物質(zhì)，也可是樣品中組分相比照移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于12.相比照移值Rs2024/5/16〔三〕吸附劑的選擇

根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力

被測物極性強——弱極性吸附劑

被測物極性弱——強極性吸附劑〔四〕展開劑的選擇〔