靜脈用中藥注射劑類過敏反應(yīng)檢測技術(shù)規(guī)范-公示稿

ICS**.***.**

C**

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CACM****－20**

靜脈用中藥注射劑類過敏反應(yīng)檢測技術(shù)規(guī)范

TECHNICALSPECIFICATIONFORTHEDETECTIONOFPSEUDO-ALLERGICREACTIONS

INDUCEDBYTRADITIONALCHINESEMEDICINEINJECTIONS

（文件類型：公示稿）

發(fā)布

1

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》

規(guī)定的規(guī)則起草。

本文件由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室共

同提出。

本文件由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)歸口。

本文件起草單位：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點(diǎn)實(shí)

驗(yàn)室、中國食品藥品檢定研究院、北京市藥品檢驗(yàn)所、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院、暨南大

學(xué)、上海中醫(yī)藥大學(xué)、天津中醫(yī)藥大學(xué)、江西青峰藥業(yè)有限公司、天津天士力之驕藥業(yè)有限

公司、華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司、神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司、麗珠集團(tuán)利民制藥廠、無

錫濟(jì)煜山禾藥業(yè)股份有限公司、上海凱寶藥業(yè)股份有限公司、廣西梧州中恒集團(tuán)股份有限公

司、山東丹紅制藥有限公司、安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司

本文件主要起草人：梁愛華、謝寧、易艷、高月、蔣春紅、張晗、胡宇馳、耿興超、李

春英、趙雍、金若敏、葉文才、鞠愛春、張宇實(shí)、韓佳寅、李科、劉地發(fā)、鄧雙炳、劉紹勇、

陳明、黃文華、姜國志、朱音、高波、王臣臣、楚慧倫、田婧卓、潘辰、王連嵋、劉素彥、

方禮、陳宣坤。

3

引言

本文件是一部指導(dǎo)靜脈給藥途徑的中藥注射劑類過敏反應(yīng)檢測的技術(shù)規(guī)范文件。

在藥物過敏樣反應(yīng)中，類過敏反應(yīng)占比約為77%；但美國FDA、國際組織ICH的相關(guān)研

究指南，美國藥典、歐洲藥典等至今仍然沒有可靠的類過敏反應(yīng)動(dòng)物模型和評(píng)價(jià)方法，注射

劑的過敏樣反應(yīng)預(yù)測、產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和控制的方法學(xué)問題一直是國際上未解決的重大科技

難題。因此，建立適合于靜脈用中藥注射劑的安全性評(píng)價(jià)方法學(xué)體系和產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)控制技術(shù)體

系和技術(shù)規(guī)范是國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域的重大需求。

該文件是在進(jìn)行了系統(tǒng)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒▽W(xué)研究后而制定的，包括不同動(dòng)物品系敏感性比較

（如ICR小鼠、昆明小鼠、C57小鼠、BALB/C小鼠等），不同性別以及不同體重動(dòng)物的類過

敏反應(yīng)差異比較研究，藥品前處理和處理后各種影響因素考察，用藥方式（劑量、濃度、體

積、速度）的影響考察，樣品重復(fù)性、操作重復(fù)性、人員比對(duì)等驗(yàn)證等。并采用多種陽性對(duì)

照品、陰性對(duì)照品以及30余種注射劑（包括中藥、西藥注射劑）等對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了驗(yàn)證，證

明了方法敏感性適宜、重復(fù)性好，結(jié)果判定客觀、可靠。

本文件有利于促進(jìn)企業(yè)對(duì)注射劑產(chǎn)品的工藝優(yōu)化及質(zhì)量提升、保障用藥安全。

4

靜脈用中藥注射劑類過敏反應(yīng)檢測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件提供了適用于靜脈用中藥注射劑類過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)與檢測的主要技術(shù)規(guī)范。

本文件適用于靜脈用中藥注射劑研發(fā)過程中的非臨床安全性評(píng)價(jià)、已上市產(chǎn)品生產(chǎn)過

程中的風(fēng)險(xiǎn)控制及上市后安全性再評(píng)價(jià)；同時(shí)，可作為從事中藥注射劑相關(guān)工作的企業(yè)、科

研、檢測人員用于類過敏風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)、檢測與控制工作參考。但并不能替代現(xiàn)行藥物過敏反

應(yīng)評(píng)價(jià)原則，二者互為補(bǔ)充。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成于本文件必不可少的條款。其中，注日

期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包

括所有的修改單）適用于本文件。

GB14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)

國家食品藥品監(jiān)督管理總局.藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].

[2014-05-13]./zdyz/domesticinfopage?zdyzIdCODE=11ed1282dd1b35641

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3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

類過敏反應(yīng)pseudo-allergicreactions

藥物類過敏反應(yīng)是藥物進(jìn)入體內(nèi)后直接刺激肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或其他細(xì)胞，釋放

血管活性物質(zhì)或致敏介質(zhì)而引起的反應(yīng)。

3.2

血管通透性vascularpermeability

物質(zhì)透過血管壁的能力稱血管通透性，也被稱為血管滲透性。

4試驗(yàn)操作要點(diǎn)

4.1檢測方法原理

臨床上，類過敏反應(yīng)癥狀與毛細(xì)血管通透性增高有關(guān)。毛細(xì)血管通透性增高是產(chǎn)生類過

5

敏反應(yīng)癥狀的主要病理機(jī)制之一。在血管通透性正常情況下，血管內(nèi)的大分子膠體物質(zhì)維持

正常的血漿滲透壓，保持液體在血管內(nèi)循環(huán)。如果在病理因素刺激下血管通透性增高，則造

成大分子物質(zhì)透過血管壁漏到血管外組織，并吸引血管內(nèi)的液體滲出而進(jìn)入組織間隙，造成

組織水腫，引起皮膚黏膜起疹、水腫、瘙癢、肺水腫、呼吸困難、缺氧、惡心、嘔吐、腹痛、

腹瀉等。血管滲透嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致血容量下降，加之引發(fā)的滲出性炎癥導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張，可

導(dǎo)致血壓下降，促進(jìn)或加重休克的發(fā)生。因此，可以以毛細(xì)血管通透性增高為指征來預(yù)測潛

在的類過敏反應(yīng)。

具有致類過敏反應(yīng)潛能的藥物首次經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，可能刺激肥大細(xì)胞、嗜堿性

粒細(xì)胞等釋放組胺或其他致敏活性因子，從而導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增高、血管擴(kuò)張。伊文思

藍(lán)(EvansBlue,EB)為常用的血管通透性指示劑。EB與血漿白蛋白具有很強(qiáng)的親合力，經(jīng)靜

脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，迅速與血漿白蛋白結(jié)合，形成白蛋白-EB復(fù)合物（ALB-EB）。當(dāng)毛細(xì)

血管通透性正常時(shí)，ALB-EB不會(huì)滲出到血管外，但當(dāng)致類過敏物質(zhì)導(dǎo)致血管通透性增高時(shí)，

ALB-EB可滲出到血管外的組織間隙，而造成組織藍(lán)染。在小鼠上，血管通透性增高造成的

組織藍(lán)染可以很直觀地在小鼠耳廓觀察到（耳藍(lán)染）。通過分析小鼠發(fā)生耳廓藍(lán)染的程度以

及定量檢測耳廓組織內(nèi)滲出的EB含量，可以客觀地評(píng)價(jià)類過敏反應(yīng)及其程度。

4.2基本原則

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境條件要求：符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010。

參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循隨機(jī)、對(duì)照、

重復(fù)的原則。類過敏反應(yīng)檢測試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組以及受試物不同劑量

（或不同濃度）組。

參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，受試物為臨床試驗(yàn)樣品

或上市藥品。并注明受試物的名稱、來源、批號(hào)、含量或規(guī)格、保存條件、配制方法、有效

期。

4.3主要試劑與器材

4.3.1主要試劑

EB（CAS：314-13-6）；所檢測的靜脈用中藥注射劑在臨床所使用的溶媒；甲酰胺（CAS：

75-12-7）；組胺（CAS:51-45-6）；Compound48/80（CAS:848035-21-2）。

6

4.3.2器材

電子天平(感量為0.1mg”針對(duì)試劑稱量；“感量為0.1g”針對(duì)動(dòng)物稱量)；酶標(biāo)儀或分光

光度計(jì)；0.22m濾膜；120目篩網(wǎng)；微孔板。

4.4操作步驟

4.4.1動(dòng)物

ICR小鼠或昆明小鼠，體重范圍23~26g(10-11周齡)，雌雄各半，每組每種性別動(dòng)物數(shù)

不少于5只。如果經(jīng)預(yù)試證明檢測結(jié)果無明顯性別差別，或者臨床上只用于單一性別，則可

選用單一性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，每組動(dòng)物數(shù)不少于10只。同一批實(shí)驗(yàn)中同一性別動(dòng)物之間體

重差異不超過20%。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1~2天。

4.4.2指示劑

采用與受試物配制相同的溶媒，將EB配制成0.8%的溶液，用0.22μM濾膜過濾除菌，

室溫避光保存；配制后的EB溶液在一周內(nèi)使用。溫度降低可導(dǎo)致EB溶解度降低而析出沉

淀，故EB溶液不宜保存于冰箱。

4.4.3對(duì)照設(shè)置

陰性對(duì)照：采用臨床推薦使用的溶媒作為陰性對(duì)照。如果受試物在臨床上被推薦為直接

靜脈注射時(shí)，則選用0.9%氯化鈉注射液作為陰性對(duì)照。

陽性對(duì)照：采用組胺或Compound48/80作為陽性對(duì)照。采用與陰性對(duì)照相同的溶媒，

臨用前配制成1%組胺溶液或2.5%Compound48/80溶液。

4.4.4受試物劑量設(shè)置

受試物設(shè)不低于2個(gè)劑量水平。可采用以下兩種方式之一設(shè)置劑量：（1）根據(jù)人與小鼠

體表面積折算系數(shù)換算為人的臨床劑量倍數(shù)進(jìn)行劑量設(shè)置，最低劑量不低于臨床等倍劑量。

為了找出安全窗，最高劑量應(yīng)不低于臨床5倍劑量。如果最高劑量達(dá)不到該水平，則依動(dòng)物

倫理原則可接受的最高給藥體積和臨床允許的最高用藥濃度作為最高劑量設(shè)計(jì)依據(jù)。（2）根

據(jù)受試物臨床使用的濃度進(jìn)行劑量設(shè)置，最高濃度不低于臨床最大用藥濃度，或可采用制劑

原液；最低濃度不低于臨床最低用藥濃度。

4.4.5注射給藥

受試物和EB溶液均為靜脈注射給予。如果說明書對(duì)注射液最高輸液滴數(shù)有明確規(guī)定，

7

則換算成對(duì)應(yīng)mL·s-1的注射速度。本試驗(yàn)的注射速度與該速度接近。如果無靜脈滴注速度規(guī)

定者，注射速度不高于0.2mL·10s-1。

一般情況下，將受試物和指示劑EB分開注射，避免互相影響?？紤]到操作的便捷性，

可以考慮合并注射。是否適合采取合并注射方式需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)判定：（1）將受試物與EB溶

液混合后，觀察是否發(fā)生渾濁、沉淀等性狀明顯變化，如果有變化則不宜合并注射；（2）考

察受試物與EB溶液合并注射、受試物與EB溶液分開注射所產(chǎn)生的類過敏反應(yīng)是否有明顯

差異（納入統(tǒng)計(jì)的動(dòng)物數(shù)每種注射方式不少于10只）。如果兩種注射方法沒有明顯差異，則

可以將受試物與EB合并注射，否則需要將二者分開注射。兩種給藥方法如下：

1）受試物與EB分開注射方式：分別配制不同濃度的受試物、0.8%EB溶液。小鼠經(jīng)尾

靜脈注射給予受試物，隨后立即注射給予0.8%EB溶液；

2）受試物與EB合并注射方式：配制不同濃度的受試物，與0.8%EB溶液1:1混合，使

EB終濃度為0.4%；小鼠經(jīng)尾靜脈注射給予混合液。

注射體積需符合動(dòng)物倫理要求，具體體積根據(jù)給藥劑量、濃度進(jìn)行確定。兩種給藥方式

進(jìn)行平行比較時(shí)，總的給藥體積應(yīng)相同。

陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組與受試物組處理方式一致。任何注射方式下，EB劑量均為

80mg?kg-1。

4.4.6結(jié)果觀察和分析

小鼠靜脈注射給藥完畢后，觀察給藥后30min內(nèi)的以下各種反應(yīng)或結(jié)果。

a）全身反應(yīng)：觀察動(dòng)物的活動(dòng)、步態(tài)、口眼鼻分泌物；是否出現(xiàn)呼吸急促或呼吸困難，

如張口呼吸、痙攣或抽搐等。

b）耳廓藍(lán)染面積評(píng)分：由兩位經(jīng)培訓(xùn)合格的研究者進(jìn)行盲法評(píng)分，采用半定量方法分

別評(píng)測并記錄每只動(dòng)物兩側(cè)耳廓的藍(lán)染面積，各取其中耳廓藍(lán)染面積最大的一側(cè)計(jì)算平均

值，再按照表1評(píng)分，作為對(duì)應(yīng)動(dòng)物的最終分值。

表1耳廓藍(lán)染面積（S）評(píng)分和程度

分值耳藍(lán)染面積

0雙耳無藍(lán)染

10＜S≤1/8（藍(lán)染面積占耳廓面積的1/8，以下類推）

21/8＜S≤1/4

31/4＜S≤1/2

8

41/2＜S≤3/4

53/4＜S≤1

c）耳廓組織中EB滲出量定量測定：給藥后30min，麻醉后脫頸椎處死小鼠。從離耳

廓與腦部折疊轉(zhuǎn)角處約2~3mm處剪下耳廓，再用剪刀剪碎，放入試管中；加入甲酰胺溶液

2ml，室溫下浸泡48h，使耳組織中的EB染料充分被萃取到甲酰胺中，溶液用200目篩網(wǎng)

過濾，去除組織殘留。取濾出液1mL，加入到微孔板中，用酶標(biāo)儀于波長610nm處測吸光

度（A）。根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算EB滲出量（μg）。

耳廓組織中EB滲出量定量測定之前，以甲酰胺為溶劑，配制0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、

6.0、8.0、10μg·ml-1等不同濃度的EB溶液，各取1ml加入到48孔板中，于610nm處用酶

標(biāo)儀測吸光度（建議標(biāo)曲各濃度均設(shè)置平行孔）；所得各濃度的吸光度數(shù)值對(duì)應(yīng)相應(yīng)濃度進(jìn)

行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.4.7判斷標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)可接受的標(biāo)準(zhǔn)

以下條件均符合時(shí)，實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為可接受。

a）陰性對(duì)照組動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分≥1的動(dòng)物數(shù)不超過10%，且陰性對(duì)照組所有動(dòng)物耳廓

藍(lán)染評(píng)分均＜2；

b）陽性對(duì)照組評(píng)分≥3的比例≥60%。

類過敏反應(yīng)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

a）以耳廓藍(lán)染面積評(píng)分為主要判斷標(biāo)準(zhǔn)：

1）受試物組動(dòng)物均未出現(xiàn)耳廓藍(lán)染，或受試物組動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分均≤1、且評(píng)分為

1的動(dòng)物數(shù)≤40%，則結(jié)果判斷為陰性；

2）受試物組動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分≥1的動(dòng)物數(shù)＞40%，且評(píng)分≥2的動(dòng)物數(shù)≤60%、且所有

動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分＜3，結(jié)果為可疑；

3）受試物組動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分≥2的動(dòng)物數(shù)>60%，且評(píng)分≥3的動(dòng)物數(shù)≤10%，則結(jié)果

判斷為弱陽性；

4）受試物組動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分≥3的動(dòng)物數(shù)>10%，且評(píng)分≥4的動(dòng)物數(shù)≤10%，則結(jié)果

判斷為陽性；

5）受試物組動(dòng)物耳廓藍(lán)染評(píng)分≥4的動(dòng)物數(shù)>10%，則結(jié)果判斷為強(qiáng)陽性。

9

如果結(jié)果為以上2）的情形，則進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)一步判斷。

b）以耳組織EB滲出量，作為輔助判斷標(biāo)準(zhǔn)：

1）與陰性對(duì)照組相比，受試物組EB滲出增高<75%，或無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，判斷

為陰性；

2）與陰性對(duì)照組相比，75%<受試物組EB滲出增高≤150%，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，

判斷為可疑；

3）與陰性對(duì)照組相比，150%<受試物組EB滲出增高≤200%，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差

異，判斷為弱陽性；

4）與陰性對(duì)照組相比，200%<受試物組EB滲出增高≤300%，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差

異，判斷為陽性；

5）與陰性對(duì)照組相比，受試物組EB滲出增高>300%，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，判斷

為強(qiáng)陽性。

輔助判斷標(biāo)準(zhǔn)僅作為參考。由于該項(xiàng)檢測取材技術(shù)要求較高，耳廓剪取時(shí)很難克服取材

范圍的操作誤差，導(dǎo)致耳廓組織中EB滲出量受到影響，可根據(jù)單位自身?xiàng)l件對(duì)該輔助判斷

標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取舍。

4.4.8注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)室控制溫度范圍20~26℃，濕度范圍為40-70%。

中藥注射劑配制時(shí)，受試物和稀釋用溶媒平衡至實(shí)驗(yàn)室溫度范圍，在潔凈環(huán)境下配制

成所需濃度，分裝于滅菌容器中備用。

耳朵為肉眼觀察血管滲出的部位，抓取動(dòng)物時(shí)應(yīng)避免捏耳朵，以免由于耳朵受擠壓而

導(dǎo)致血管滲出，造成假陽性。

注射操作必須很熟練，避免多次穿刺而造成血管機(jī)械損傷。

注射量要準(zhǔn)確，避免藥液被注射到皮下或血管外。

10

目次

前言錯(cuò)誤!未定義書簽。

引言4

1范圍5

2規(guī)范性引用文件5

3術(shù)語和定義5

4試驗(yàn)操作要點(diǎn)6

2

靜脈用中藥注射劑類過敏反應(yīng)檢測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件提供了適用于靜脈用中藥注射劑類過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)與檢測的主要技術(shù)規(guī)范。

本文件適用于靜脈用中藥注射劑研發(fā)過程中的非臨床安全性評(píng)價(jià)、已上市產(chǎn)品生產(chǎn)過

程中的風(fēng)險(xiǎn)控制及上市后安全性再評(píng)價(jià)；同時(shí)，可作為從事中藥注射劑相關(guān)工作的企業(yè)、科

研、檢測人員用于類過敏風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)、檢測與控制工作參考。但并不能替代現(xiàn)行藥物過敏反

應(yīng)評(píng)價(jià)原則，二者互為補(bǔ)充。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成于本文件必不可少的條款。其中，注日

期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包

括所有的修改單）適用于本文件。

GB14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)

國家食品藥品監(jiān)督管理總局.藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].

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943de34907b317c

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

類過敏反應(yīng)pseudo-allergicreactions

藥物類過敏反應(yīng)是藥物進(jìn)入體內(nèi)后直接刺激肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或其他細(xì)胞，釋放

血管活性物質(zhì)或致敏介質(zhì)而引起的反應(yīng)。

3.2

血管通透性vascularpermeability

物質(zhì)透過血管壁的能力稱血管通透性，也被稱為血管滲透性。

4試驗(yàn)操作要點(diǎn)

4.1檢測方法原理

臨床上，類過敏反應(yīng)癥狀與毛細(xì)血管通透性增高有關(guān)。毛細(xì)血管通透性增高是產(chǎn)生類過

5

敏反應(yīng)癥狀的主要病理機(jī)制之一。在血管通透性正常情況下，血管內(nèi)的大分子膠體物質(zhì)維持

正常的血漿滲透壓，保持液體在血管內(nèi)循環(huán)。如果在病理因素刺激下血管通透性增高，則造

成大分子物質(zhì)透過血管壁漏到血管外組織，并吸引血管內(nèi)的液體滲出而進(jìn)入組織間隙，造成

組織水腫，引起皮膚黏膜起疹、水腫、瘙癢、肺水腫、呼吸困難、缺氧、惡心、嘔吐、腹痛、

腹瀉等。血管滲透嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致血容量下降，加之引發(fā)的滲出性炎癥導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張，可

導(dǎo)致血壓下降，促進(jìn)或加重休克的發(fā)生。因此，可以以毛細(xì)血管通透性增高為指征來預(yù)測潛

在的類過敏反應(yīng)。

具有致類過敏反應(yīng)潛能的藥物首次經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，可能刺激肥大細(xì)胞、嗜堿性

粒細(xì)胞等釋放組胺或其他致敏活性因子，從而導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增高、血管擴(kuò)張。伊文思

藍(lán)(EvansBlue,EB)為常用的血管通透性指示劑。EB與血漿白蛋白具有很強(qiáng)的親合力，經(jīng)靜

脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，迅速與血漿白蛋白結(jié)合，形成白蛋白-EB復(fù)合物（ALB-EB）。當(dāng)毛細(xì)

血管通透性正常時(shí)，ALB-EB不會(huì)滲出到血管外，但當(dāng)致類過敏物質(zhì)導(dǎo)致血管通透性增高時(shí)，

ALB-EB可滲出到血管外的組織間隙，而造成組織藍(lán)染。在小鼠上，血管通透性增高造成的

組織藍(lán)染可以很直觀地在小鼠耳廓觀察到（耳藍(lán)染）。通過分析小鼠發(fā)生耳廓藍(lán)染的程度以

及定量檢測耳廓組織內(nèi)滲出的EB含量，可以客觀地評(píng)價(jià)類過敏反應(yīng)及其程度。

4.2基本原則

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境條件要求：符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010。

參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循隨機(jī)、對(duì)照、

重復(fù)的原則。類過敏反應(yīng)檢測試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組以及受試物不同劑量

（或不同濃度）組。

參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，受試物為臨床試驗(yàn)樣品

或上市藥品。并注明受試物的名稱、來源、批號(hào)、含量或規(guī)格、保存條件、配制方法、有效

期。

4.3主要試劑與器材

4.3.1主要試劑

EB（CAS：314-13-6）；所檢測的靜脈用中藥注射劑在臨床所使用的溶媒；甲酰胺（CAS：

75-12-7）；組胺（CAS:51-45-6）；Compound48/80（CAS:848035-21-2）。

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4.3.2器材

電子天平(感量為0.1mg”針對(duì)試劑稱量；“感量為0.1g”針對(duì)動(dòng)物稱量)；酶標(biāo)儀或分光

光度計(jì)；0.22m濾膜；120目篩網(wǎng)；微孔板。

4.4操作步驟

4.4.1動(dòng)物

ICR小鼠或昆明小鼠，體重范圍23~26g(10-11周齡)，雌雄各半，每組每種性別動(dòng)物數(shù)

不少于5只。如果經(jīng)預(yù)試證明檢測結(jié)果無明顯性別差別，或者臨床上只用于單一性別，則可

選用單一性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，每組動(dòng)物數(shù)不少于10只。同一批實(shí)驗(yàn)中同一性別動(dòng)物之間體

重差異不超過20%。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1~2天。

4.4.2指示劑

采用與受試物配制相同的溶媒，將EB配制成0.8%的溶液，用0.22μM濾膜過濾除菌，

室溫避光保存；配制后的EB溶液在一周內(nèi)使用。溫度降低可導(dǎo)致EB溶解度降低而析出沉

淀，故EB溶液不宜保存于冰箱。

4.4.3對(duì)照設(shè)置

陰性對(duì)照：采用臨床推薦使用的溶媒作為陰性對(duì)照。如果受試物在臨床上被推薦為直接

靜脈注射時(shí)，則選用0.9%氯化鈉注射液作為陰性對(duì)照。

陽性對(duì)照：采用組胺或Compound48/80作為陽性對(duì)照。采用與陰性對(duì)照相同的溶媒，

臨用前配制成1%組胺溶液或2.5%Compound48/80溶液。

4.4.4受試物劑量設(shè)置

受試物設(shè)不低于2個(gè)劑量水平。可采用以下兩種方式之一設(shè)置劑量：（1）根據(jù)人與小鼠

體表面積折算系數(shù)換算為人的臨床劑量倍數(shù)進(jìn)行劑量設(shè)置，最低劑量不低于臨床等倍劑量。

為了找出安全窗，最高劑量應(yīng)不低于臨床5倍劑量。如果最高劑量達(dá)不到該水平，則依動(dòng)物

倫理原則可接受的最高給藥體積和臨床允許的最高用藥濃度作為最高劑量設(shè)計(jì)依據(jù)。（2）根

據(jù)受試物臨床使用的濃度進(jìn)行劑量設(shè)置，最高濃度不低于臨床最大用藥濃度，或可采用制劑

原液；最低濃度不低于臨床最低用藥濃度。

4.4.5注射給藥

受試物和EB溶液均為靜脈注射給予。如果說明書對(duì)注射液最高輸液滴數(shù)有明確規(guī)定，

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則換算成對(duì)應(yīng)mL·s-1的注射速度。本試驗(yàn)的注射速度與該速度接近。如果無靜脈滴注速度規(guī)

定者，注射速度不高于0.2mL·10s-1。

一般情況下，將受試物和指示劑EB分開注射，避免互相影響。考慮到操作的便捷性，

可以考慮合并注射。是否適合采取合并注射方式需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)判定：（1）將受試物與EB溶

液混合后，觀察是否發(fā)生渾濁、沉淀等性狀明顯變化，如果有變化則不宜合并注射；（2）考

察受試物與EB溶液合并注射、受試物與EB溶液分開注射所產(chǎn)生的類過敏反應(yīng)是否有明顯

差異（納入統(tǒng)計(jì)的動(dòng)物數(shù)每種注射方式不少于10只）。如果兩種注射方法沒有明顯差異，則

可以將受試物與EB合并注射，否則需要將二者分開注射。兩種給藥方法如下：

1）受試物與EB分開注射方式：分別配制不同濃度的受試物、0.8%EB溶液。小鼠經(jīng)尾

靜脈注射給予受試物，隨后立即注射給予0.8%EB溶液；

2）受試物與EB合并注射方式：配制不同濃度的受試物，與0.8%EB溶液1:1混合，使

EB終濃度為0.4%；小鼠經(jīng)尾靜脈注射給予混合液。

注射體積需符合動(dòng)物倫理要求，具體體積根據(jù)給藥劑量、濃度進(jìn)行確定。兩種給藥方式

進(jìn)行平行比較時(shí)，總的給藥體積應(yīng)相同。

陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組與受試物組處理方式一致。任何注射方式下，EB劑量均為

80mg?kg-1。

4.4.6結(jié)果觀察和分析

小鼠靜脈注射給藥完畢后，觀察給藥后30min內(nèi)的以下各種反應(yīng)或結(jié)果。

a）全身反應(yīng)：觀察動(dòng)物的活動(dòng)、步態(tài)、口眼鼻分泌物；是否出現(xiàn)呼吸急促或呼吸困難，

如張口呼吸、痙攣或抽搐等。

b）耳廓藍(lán)染面積評(píng)分：由兩位經(jīng)培訓(xùn)合格的研究者進(jìn)行盲法評(píng)分，采用半定量方法分

別評(píng)測并記錄每只動(dòng)物兩側(cè)耳廓的藍(lán)染面積，各取其中耳廓藍(lán)染面積最大的一側(cè)計(jì)算平均

值，再按照表1評(píng)分，作為對(duì)應(yīng)動(dòng)物的最終分值。

表1耳廓藍(lán)染面積（S）評(píng)分和程度

分值耳藍(lán)染面積

0雙耳無藍(lán)染

10＜S≤1/8（藍(lán)染面積占耳廓面積的1/8，以下類推）

21/8＜S≤1/4

31/4＜S≤1/2

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41/2＜S≤3/4

53/4＜S≤1

c）耳廓組織中EB滲出量定量測定：給藥后30min，麻醉后脫頸椎處死小鼠。從離耳

廓與腦部折疊轉(zhuǎn)角處約2~3mm處剪下耳廓，再用剪刀剪碎，放入試管中；加入甲酰胺溶液

2ml，室溫下浸泡48h，使耳組織中的EB染料充分被萃取到甲酰胺中，溶液用200目篩網(wǎng)

過濾，去除組織殘留。取濾出液1mL，加入到微孔板中，用酶標(biāo)儀于波長610nm處測吸光

度（A）。根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算EB滲出量（μg）。

耳廓組織中EB滲出量定量測定之前，以甲酰胺為溶劑，配制0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、

6.0、8.0、10μg·ml-1等不同濃度的EB溶液，各取1ml加入到48孔板中，于610nm處用酶

標(biāo)儀測吸光度（建議標(biāo)曲各濃度均設(shè)置平行