免疫分析法專題知識(shí)專家講座

一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容免疫分析法專題知識(shí)專家講座第1頁(yè)一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容免疫分析法專題知識(shí)專家講座第2頁(yè)免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功效，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對(duì)機(jī)體有益防衛(wèi)功效和有害病理?yè)p傷機(jī)制，研究有效免疫辦法，實(shí)現(xiàn)以防病，治病為目標(biāo)一門當(dāng)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。一、概述免疫分析法專題知識(shí)專家講座第3頁(yè)什么叫免疫分析？基于抗原和抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)一個(gè)技術(shù)伎倆?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與對(duì)應(yīng)抗體之間發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。它既能夠發(fā)生在體內(nèi)，也能夠發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)為體液免疫應(yīng)答效應(yīng)作用。體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要用于抗原或抗體檢測(cè)，用于免疫學(xué)診療。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第4頁(yè)(1)在試驗(yàn)藥品動(dòng)力學(xué)和臨床藥品學(xué)中，測(cè)定生物利用度和藥品代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中主要數(shù)據(jù)，方便了解藥品在體內(nèi)吸收、分解、代謝和排泄情況；(2)在藥品臨床檢測(cè)中，對(duì)治療指數(shù)小、超出安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最正確治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉藥品血液濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)；(3)在藥品生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測(cè)定有效組分含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程在線監(jiān)測(cè)；(4)對(duì)藥品中是否存在特定微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在藥品分析中，免疫分析法應(yīng)用主要集中在以下幾方面：免疫分析法專題知識(shí)專家講座第5頁(yè)免疫分析：

利用抗原與抗體特異性結(jié)合作用，來(lái)選擇性識(shí)別和測(cè)定，能夠作為抗體或抗原待測(cè)物.免疫分析方法非標(biāo)識(shí)免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生改變）標(biāo)識(shí)免疫分析標(biāo)識(shí)物有沒(méi)有非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）酶聯(lián)免疫分析熒光免疫分析電化學(xué)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析免疫分析免疫分析法專題知識(shí)專家講座第6頁(yè)免疫分析檢測(cè)發(fā)展放射免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)70年代)酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表光生物學(xué)標(biāo)識(shí)及免疫檢測(cè)技術(shù)（20世紀(jì)90年代開(kāi)始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)久）三個(gè)階段。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第7頁(yè)特點(diǎn)可逆性百分比性反應(yīng)階段性特異性免疫分析法特點(diǎn)免疫分析法專題知識(shí)專家講座第8頁(yè)特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)專一性分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型互補(bǔ)性免疫分析法專題知識(shí)專家講座第9頁(yè)可逆性可逆性：抗原與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后抗原或抗體均能保持原有結(jié)構(gòu)和活性。影響原因：

抗體對(duì)對(duì)應(yīng)抗原親協(xié)力－－親協(xié)力越高，結(jié)合越牢靠，越不易解離環(huán)境原因?qū)?fù)合物影響－pH、離子強(qiáng)度免疫分析法專題知識(shí)專家講座第10頁(yè)百分比性和反應(yīng)階段性百分比性：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵照一定量比關(guān)系前帶(prezone)：抗體過(guò)量后帶(postzone)：抗原過(guò)量等價(jià)帶(equivalencezone)：抗原抗體百分比適當(dāng)

免疫分析法專題知識(shí)專家講座第11頁(yè)一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容免疫分析法專題知識(shí)專家講座第12頁(yè)2.1定義抗原（antigen）：指在機(jī)體中引發(fā)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)物質(zhì)。免疫原性（immunogenicity）：被注射入動(dòng)物體內(nèi)后，使其產(chǎn)生循環(huán)抗體或改變免疫細(xì)胞反應(yīng)性抗原特異性（antigenicspecificity）：含有能與特異抗體作用性質(zhì)全抗原（completeantigen）半抗原（hapten）：只能與特異抗體作用，但不引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答分子免疫分析法專題知識(shí)專家講座第13頁(yè)2.2藥品分子抗原性1、藥品分子免疫原性大多數(shù)藥品分子通常都是半抗原；一些蛋白類藥品、多肽類藥品、激素類藥品也是完全抗原。2、藥品分子抗原特異性藥品分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗原特異性可能會(huì)發(fā)生改變。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第14頁(yè)3、藥品分析中，為了得到高效價(jià)抗血清，通常會(huì)與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進(jìn)行試驗(yàn)。慣用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第15頁(yè)（1）半抗原和載體結(jié)合化學(xué)反應(yīng)多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽游離羧基縮合形成肽鍵甾體：經(jīng)過(guò)含游離羧基甾體衍生物與載體蛋白相連抗生素：?-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下能夠與蛋白質(zhì)自由氨基以酰胺鍵形式共價(jià)結(jié)合；氨基糖苷類抗生素用碳化二亞胺為連接劑實(shí)現(xiàn)藥品和載體蛋白連接免疫分析法專題知識(shí)專家講座第16頁(yè)（2）半抗原和載體選擇標(biāo)準(zhǔn)

半抗原：最好含有芳香結(jié)構(gòu)；應(yīng)考慮抗原抗體反應(yīng)微環(huán)境；合理利用分子類似物之間交叉反應(yīng)。載體：載體對(duì)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)影響；載體效應(yīng)在免疫過(guò)程中影響。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第17頁(yè)（3）合成抗原測(cè)定定性測(cè)定方法：光譜分析、熱力學(xué)分析定量測(cè)定方法：相對(duì)含量測(cè)定；絕對(duì)含量測(cè)定。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第18頁(yè)一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容免疫分析法專題知識(shí)專家講座第19頁(yè)免疫分析實(shí)際上是一個(gè)特殊試劑分析，特點(diǎn)是抗體成為分析試劑。

免疫分析法專題知識(shí)專家講座第20頁(yè)1、抗體結(jié)構(gòu)與功效

抗體泛指與待測(cè)分子特異性結(jié)合蛋白質(zhì)分子，包含免疫球蛋白（immunoglobulin）,受體（receptor）和其它結(jié)合蛋白質(zhì)，主要是免疫球蛋白，慣用是IgG分子.免疫分析法專題知識(shí)專家講座第21頁(yè)免疫球蛋白基本結(jié)構(gòu)

IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成，二條較小輕鏈和二條較大重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。

免疫分析法專題知識(shí)專家講座第22頁(yè)抗體基本結(jié)構(gòu)免疫分析法專題知識(shí)專家講座第23頁(yè)IgG分子由四條多肽鏈組成，以二硫鍵相連，有三個(gè)功效區(qū)?？贵w在Fab區(qū)結(jié)合抗原分子，同時(shí)經(jīng)過(guò)hi區(qū)轉(zhuǎn)動(dòng)以適應(yīng)不一樣距離抗原決定簇。與抗原結(jié)合后，IgG分子構(gòu)象改變，暴露出Fc上活性位點(diǎn)，從而表現(xiàn)出固定和激活補(bǔ)體以及粘結(jié)單核細(xì)胞等親細(xì)胞反應(yīng)功效。Fab：抗原結(jié)合片段Fc：可結(jié)晶片段免疫分析法專題知識(shí)專家講座第24頁(yè)胃蛋白酶木瓜蛋白酶巰基乙醇還原免疫分析法專題知識(shí)專家講座第25頁(yè)胃蛋白酶（pepsin）水解片段

裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（C端）裂解片段，F(xiàn)（ab’）2，無(wú)Fc片段與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng)免疫分析法專題知識(shí)專家講座第26頁(yè)木瓜蛋白酶（papain）水解片段

裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（N端）裂解片段，2個(gè)Fab（54KD），一個(gè)Fc（50KD）,Fab與抗原結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)。

免疫分析法專題知識(shí)專家講座第27頁(yè)2．抗體作為分析試劑評(píng)價(jià)

抗體特異性是無(wú)與倫比，不需或只需要簡(jiǎn)單預(yù)處理。有較高穩(wěn)定性。這兩點(diǎn)奠定了分析免疫高度靈敏和高度專一基礎(chǔ)。另外，抗體還有一個(gè)獨(dú)特性質(zhì)：每個(gè)抗體分子有兩個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)，即多價(jià)性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備分析信號(hào)反差。

免疫分析法專題知識(shí)專家講座第28頁(yè)3、抗體制備（1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體）：指人工被動(dòng)免疫后制成多克隆抗體，是免疫分析中主要工具。免疫原制備、動(dòng)物免疫、放血、抗血清分離及抗血清分析判定。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第29頁(yè)免疫原制備免疫原由質(zhì)量好抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。水劑由無(wú)菌生理鹽水將抗原制成一定濃度免疫原。弗氏佐劑是由一定量羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨到達(dá)油包水程度。不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第30頁(yè)動(dòng)物免疫通常免疫動(dòng)物為家兔和羊。免疫部位多采取腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點(diǎn)、靜脈。免疫抗原量通常為1~10mg或50~100mg。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第31頁(yè)試血及效價(jià)測(cè)定家兔試血通常可由耳緣靜脈取血，取血量0.5ml。不一樣稀釋度抗血清和1%血細(xì)胞懸液按1:1混合，37℃保溫2h后觀察血細(xì)胞凝聚情況，即可測(cè)得免疫血清效價(jià)。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第32頁(yè)（2）單克隆抗體單克隆抗體是建立在經(jīng)細(xì)胞融合而取得雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上。所取得抗體含有均一特異性。高度均質(zhì)性特異性抗體，由一個(gè)識(shí)別單一抗原表位B細(xì)胞克隆所分泌。普通來(lái)自雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)法&接種動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法免疫分析法專題知識(shí)專家講座第33頁(yè)制備步驟免疫分析法專題知識(shí)專家講座第34頁(yè)2、抗體純化利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類免疫球蛋白。利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專一性抗體。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第35頁(yè)3、特異性抗體篩選與效價(jià)測(cè)定抗體效價(jià)又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要量。免疫分析中，免疫血清中抗體效價(jià)指將血清稀釋，測(cè)定與一定抗原能發(fā)生反應(yīng)最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清效價(jià)。慣用效價(jià)測(cè)定方法有免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和ELISA法等。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第36頁(yè)一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容免疫分析法專題知識(shí)專家講座第37頁(yè)四、免疫分析方法及其應(yīng)用放射免疫分析法（RIA）熒光免疫分析法（FIA）克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）免疫分析法專題知識(shí)專家講座第38頁(yè)放射免疫分析法（radioimmunoassay,RIA）1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)識(shí)抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過(guò)量抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法顯著提升，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量范圍也顯著擴(kuò)大。因?yàn)樘禺愋詥慰寺】贵w用于免疫放射分析，使本法得到了更加快發(fā)展。近年來(lái)，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法愈加完善。放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣一類競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù).免疫分析法專題知識(shí)專家講座第39頁(yè)基本原理

基本原理：放射性標(biāo)識(shí)抗原與非標(biāo)識(shí)抗原（包含標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原）與有限量特異性抗體發(fā)生可逆性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來(lái)表示：抗原

抗體慣用標(biāo)識(shí)物：125I和氚標(biāo)識(shí)物放射性活度（貝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰變比活度（Bp/g）：每單位質(zhì)量所含放射性比活度游離狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)免疫分析法專題知識(shí)專家講座第40頁(yè)詳細(xì)步驟

抗原抗體反應(yīng)結(jié)合和游離放射性物質(zhì)分離放射性活度測(cè)定柱色譜法吸附法沉淀法抗抗體發(fā)微孔濾膜法固相法求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量反應(yīng)曲線）免疫分析法專題知識(shí)專家講座第41頁(yè)熒光免疫分析法（Fluorescenceimmunoassay,FIA）免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)特異性和

敏感性與顯微示蹤準(zhǔn)確性相結(jié)合一項(xiàng)技術(shù)以熒光素作為標(biāo)識(shí)物，與已知抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特征。然后將熒光素標(biāo)識(shí)抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和判定未知抗原免疫分析法專題知識(shí)專家講座第42頁(yè)熒光免疫分析法（Fluorescenceimmunoassay,FIA）在熒光顯微鏡下，能夠直接觀察展現(xiàn)特異性熒光抗原抗體復(fù)合物及其存在部位在實(shí)際工作中，因?yàn)闊晒馑貥?biāo)識(shí)抗體檢驗(yàn)抗原方法較為慣用，所以普通通稱為熒光抗體技術(shù)免疫分析法專題知識(shí)專家講座第43頁(yè)依據(jù)試驗(yàn)方法分類直接法間接法補(bǔ)體法其它免疫分析法專題知識(shí)專家講座第44頁(yè)直接法將熒光標(biāo)識(shí)特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異性染色少敏感性低抗原標(biāo)識(shí)抗體熒光免疫分析法專題知識(shí)專家講座第45頁(yè)間接法先用已知未標(biāo)識(shí)特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)識(shí)抗體（二抗）與其反應(yīng)，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢未知抗原未標(biāo)識(shí)抗體標(biāo)識(shí)抗體熒光免疫分析法專題知識(shí)專家講座第46頁(yè)補(bǔ)體法利用補(bǔ)體反應(yīng)，經(jīng)過(guò)形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光補(bǔ)體標(biāo)識(shí)抗補(bǔ)體抗體免疫分析法專題知識(shí)專家講座第47頁(yè)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定利用含有雙功效基團(tuán)結(jié)構(gòu)螯合劑，將鑭系元素標(biāo)識(shí)到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，因?yàn)殍|系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合成份后，利用時(shí)間分辨熒光儀即可測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而推測(cè)待測(cè)物含量。免疫分析法專題知識(shí)專家講座第48頁(yè)基本原理它采取抗原與抗體特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后經(jīng)過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定對(duì)象能夠是抗體也能夠是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要試劑：①固相抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體（標(biāo)識(shí)物）③酶作用底物（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）免疫分析法專題知識(shí)專家講座第49頁(yè)免疫分析法專題知識(shí)專家講座第50頁(yè)雙抗體夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。

它是檢測(cè)抗原最慣用ELISA，適合用于檢測(cè)分子中含有最少兩個(gè)抗原決定簇多價(jià)抗原。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物形成量與待測(cè)抗原含量成正比。測(cè)定復(fù)合物中酶作用于加入底物后生成有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測(cè)抗原含量。