蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)課件

蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)

1可編輯課件PPT蛋白質(zhì)分子中的結(jié)構(gòu)層次

一級(jí)結(jié)構(gòu)→二級(jí)結(jié)構(gòu)→超二級(jí)結(jié)構(gòu)→結(jié)構(gòu)域→三級(jí)結(jié)構(gòu)→亞基→四級(jí)結(jié)構(gòu)2可編輯課件PPT定義蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。一、蛋白質(zhì)的一級(jí)(共價(jià))結(jié)構(gòu)主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。

3可編輯課件PPTN末端C末端牛核糖核酸酶4可編輯課件PPT一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。5可編輯課件PPT胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的根本差異在于一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同6可編輯課件PPT多肽鏈中氨基酸序列分析——一級(jí)結(jié)構(gòu)測定準(zhǔn)備工作：樣品純度97%以上；測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量（允許誤差10%左右）測定肽的數(shù)目；測定氨基酸組成7可編輯課件PPT多肽鏈中氨基酸序列分析

分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成（純度97%以上）

測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基

把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析

測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序結(jié)果。8可編輯課件PPT胰蛋白酶：水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵；糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：水解芳香族氨基酸【苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）】等氨基酸殘基的羧基形成的肽鍵。胃蛋白酶：專一性較差，主要水解Glu、Asp或其他氨基酸的側(cè)鏈。9可編輯課件PPT則其氨基酸排列順序?yàn)椋?/p>

Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如測一個(gè)九肽測得N端氨基酸殘基為Thr又分別測得片段:

Ala-Ala-Trp-Gly-Lys

Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys10可編輯課件PPT例1：某五肽先經(jīng)酸水解再經(jīng)堿水解，得到摩爾數(shù)相等的五種氨基酸（Ala、Cys、Lys、Phe和Ser）混合物，用Edman分析法進(jìn)行N端分析，獲得PHT-Ser；經(jīng)胰蛋白酶水解可得到一種N端為Cys的三肽和另一種N端為Ser的二肽；用胰糜蛋白酶水解上述三肽，得到Ala和另一個(gè)二肽。問該五肽的氨基酸順序怎樣？解答：1、是一個(gè)N端為Ser的五肽；2、胰蛋白酶的水解部位是Lys或Arg的羧基端肽鍵，因?yàn)榈玫揭环NN端為Ser的二肽，因此第二位為Lys；3、經(jīng)胰蛋白酶水解可得到一種N端為Cys的三肽，所以第三位為Cys；4、因?yàn)橐让拥鞍酌钢凰夥枷阕灏被岬聂然穗逆I，水解上述三肽，得到Ala和另一個(gè)二肽，所以三肽為：Cys-Phe-Ala5、整個(gè)五肽的順序?yàn)镾er-Lys-Cys-Phe-Ala。11可編輯課件PPT例2：

當(dāng)一種4肽與FDNB反應(yīng)后,用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val及3種其他氨基酸;當(dāng)這4肽用胰蛋白酶水解時(shí)發(fā)現(xiàn)有兩種碎片段，其中一片用LiBH4還原后再進(jìn)行酸水解,水解液內(nèi)有氨基乙醇和一種在有濃硫酸條件下能與已醛酸反應(yīng)產(chǎn)生紫(紅)色產(chǎn)物的氨基酸.試問這4肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由哪幾種氨基酸。（LiBH4還原羧酸成為醇類，可使C-末端AA還原為相應(yīng)的氨基醇。）1、分析：FDNB即2，4-二硝基氟苯，在弱堿性溶液中可與肽鏈N-末端的氨基酸生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。鹽酸水解可以打開所有的肽鏈，使蛋白質(zhì)或者多肽變?yōu)橛坞x的氨基酸。LiBH4還原羧酸成為醇類，可使C-末端AA還原為相應(yīng)的氨基醇。胰蛋白酶可專一性水解由堿性氨基酸（lys，Arg）羧基端形成的肽鍵。12可編輯課件PPT解題：（1）四肽與FDNB反應(yīng)后，用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val，證明N端為Val；

（2）LiBH4還原后再水解，水解液中有氨基乙醇，Gly是氨基乙酸，證明肽的C端為Gly；

（3）水解液中有在濃H2SO4條件下能與乙醛酸反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色產(chǎn)物的氨基酸，說明此氨基酸為Trp；

（4）根據(jù)胰蛋白酶的專一性，得知此肽鍵-COOH末端是Lys或者Arg；

根據(jù)以上結(jié)果可知道四肽的順序：Val·Lys·Trp·Gly或者Val·Arg·Trp·Gly。13可編輯課件PPT二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊盤繞方式。定義

主要的化學(xué)鍵：

氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力

14可編輯課件PPT（一）酰胺平面參與形成肽鍵的4個(gè)原子（C、O、N、H）和與之相連的2個(gè)-碳原子（

C

1、C

2）共處于同一平面上，形成酰胺平面，或稱肽鍵平面，肽平面，肽單元。C

1和C

2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型。15可編輯課件PPT它是蛋白質(zhì)構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位16可編輯課件PPT

（二）蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

17可編輯課件PPT1、

-螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn):①從N端為起點(diǎn)，多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。18可編輯課件PPT

19可編輯課件PPT多個(gè)肽鍵平面通過α-碳原子旋轉(zhuǎn)，相互之間緊密盤曲成穩(wěn)固的右手螺旋。每個(gè)肽鍵的亞氨氫和第四個(gè)肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定（氫鍵是穩(wěn)定α－螺旋的主要鍵），氫鍵與螺旋長軸基本平行。主鏈呈螺旋上升，每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，沿軸旋轉(zhuǎn)1000，每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于上升高度(螺距)0.54nm，螺旋的直徑約為0.5nm。α－螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)20可編輯課件PPT例題：一個(gè)α螺旋片段含有180個(gè)氨基酸殘基，該片段中有多少圈螺旋？計(jì)算該α-螺旋片段的軸長。

解答：180/3.6=50圈，50×0.54=27nm，該片段中含有50圈螺旋，其軸長為27nm。例題：一個(gè)含有78個(gè)氨基酸殘基的α螺旋的軸長是多少？此多肽的α螺旋完全伸展時(shí)多長？

解答：78×0.15=11.7nmα螺旋每圈螺旋占3.6個(gè)氨基酸殘基，故該α螺旋圈數(shù)為：78÷3.6圈；α螺旋的直徑約為0.5nm，故每圈軸長為0.5πnm。

完全伸展的α螺旋長度約為：0.5π×（78÷3.6）≌34.01nm21可編輯課件PPT22可編輯課件PPT多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈位于鋸齒結(jié)構(gòu)的上下方。2、-折疊23可編輯課件PPT

-折疊②

-折疊結(jié)構(gòu)的肽鏈幾乎是完全伸展的，兩段以上的β-折疊結(jié)構(gòu)平行排列，兩鏈間可順向平行，也可反向平行，反平行結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β-折疊結(jié)構(gòu)。氫鍵與螺旋長軸垂直。24可編輯課件PPT反平行25可編輯課件PPT平行26可編輯課件PPT3、-轉(zhuǎn)角蛋白質(zhì)多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180?的回折，這種肽鏈回折處的稱為

-轉(zhuǎn)角（

-tern）或

-bend，或稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpinstructure）。27可編輯課件PPT一般由四個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成，第一個(gè)氨基酸殘基與第四個(gè)形成氫鍵。28可編輯課件PPT4、Ω環(huán)Ω環(huán)多存在于球狀蛋白質(zhì)分子中，形狀像“Ω”，稱為Ω環(huán)（Ωloop）。由6-16個(gè)氨基酸殘基組成29可編輯課件PPT5、無規(guī)卷曲（自由回轉(zhuǎn)）是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的功能部位常位于這種構(gòu)象區(qū)域H2NCOOH30可編輯課件PPT氨基酸殘基的側(cè)鏈對二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是以一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈的氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成

-螺旋或β-折疊時(shí)，它就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。31可編輯課件PPT1、超二級(jí)結(jié)構(gòu)（Supersecondarystructure）在蛋白質(zhì)分子中，由若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。

幾種類型的超二級(jí)結(jié)構(gòu)：ααβββαβ（三）二、三級(jí)過渡態(tài)——

蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域32可編輯課件PPT2、結(jié)構(gòu)域多肽鏈在超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成較為緊密的近似球狀或纖維狀、具有部分生物功能的結(jié)構(gòu)，稱為結(jié)構(gòu)域(domain)大分子蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域(domain)。33可編輯課件PPT纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域丙糖磷酸異構(gòu)酶34可編輯課件PPT三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（二）主要的化學(xué)鍵非共價(jià)鍵：疏水鍵:多肽鏈上疏水性較強(qiáng)的氨基酸的非極性側(cè)鏈避開水相自相粘附聚集在一起，形成空穴。離子鍵（鹽?。?由蛋白質(zhì)中正、負(fù)電荷的側(cè)鏈基團(tuán)相互接近，通過靜電吸引而形成的基團(tuán)之間的作用力。氫鍵：范德華力等（一）定義：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。由一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域組裝而成的結(jié)構(gòu)。35可編輯課件PPT36可編輯課件PPT

肌紅蛋白(Mb)N端C端37可編輯課件PPT亞基之間的結(jié)合力主要是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布、亞基間通過非共價(jià)鍵聚合而成的特定構(gòu)象，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，肽鏈間相互以非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)成一個(gè)活性單位，這種肽鏈就稱為該蛋白質(zhì)的亞基。38可編輯課件PPT血紅蛋白（Hb）的四級(jí)結(jié)構(gòu)39可編輯課件PPT從一級(jí)結(jié)構(gòu)到四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白40可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是它的氨基酸序列，維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)的鍵：肽鍵、二硫鍵蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由氫鍵導(dǎo)致的肽鏈卷曲與折疊Primary

structureSecondary

structure41可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈自然形成的三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是亞基的空間排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure42可編輯課件PPT維系蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)：疏水鍵氫鍵范德華力鹽鍵（離子鍵）43可編輯課件PPT蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)44可編輯課件PPT（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系牛核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵45可編輯課件PPT

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性46可編輯課件PPT（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)47可編輯課件PPT

這種由蛋白質(zhì)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。正常紅細(xì)胞鐮刀形細(xì)胞48可編輯課件PPT（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系目錄49可編輯課件PPT（二）血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。50可編輯課件PPT肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線51可編輯課件PPT*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)52可編輯課件PPT53可編輯課件PPTO2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動(dòng)。54可編輯課件PPT變（別）構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)某些蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物學(xué)功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變了整個(gè)分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)。55可編輯課件PPT(R)relaxedstate(T)tensestate

血液中O2的運(yùn)輸(HbR/T態(tài)的互換)Lung氧分子Hemoglobin血紅蛋白Myoglobin肌紅蛋白Muscle靜脈動(dòng)脈環(huán)境氧濃度高時(shí)Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時(shí)Hb迅速釋放氧氣任何一個(gè)亞基接受O2后，會(huì)增加其他亞基吸收O2的能力釋放氧氣后Hb變回

Tstate56可編輯課件PPT（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。57可編輯課件PPT蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。58可編輯課件PPT瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病59可編輯課件PPT第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein60可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的紫外吸收一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)61可編輯課件PPT1、蛋白質(zhì)的兩性解離和電泳現(xiàn)象蛋白質(zhì)分子與多肽、氨基酸一樣，除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)使其成為人體及動(dòng)物體中的重要緩沖劑，調(diào)節(jié)體液正常pH。蛋白質(zhì)62可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)較穩(wěn)定，其溶解度、導(dǎo)電性、黏度、滲透壓等皆最?。ㄖ苽浠虺恋淼鞍踪|(zhì)），在電場中不移動(dòng)（分離蛋白質(zhì)）。63可編輯課件PPT

在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。64可編輯課件PPT電泳蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。65可編輯課件PPT例題根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，指出下列蛋白質(zhì)在所指定的pH條件下，電泳時(shí)的泳動(dòng)方向：

(1)胃蛋白酶(pI

1.0)，在pH

5.0；帶負(fù)電，向正極泳動(dòng)

(2)血清清蛋白(pI

4.9)，在pH

6.0；帶負(fù)電，向正極泳動(dòng)

(3)α-脂蛋白(pI

5.8)，在pH

5.0和pH

9.0；

在pH

5.0時(shí)帶正電，向負(fù)極泳動(dòng)；在pH

9.0帶負(fù)電，向正極泳動(dòng)

66可編輯課件PPT2蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。因此，它在水中能夠形成膠體溶液。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜67可編輯課件PPT+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉68可編輯課件PPT蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。69可編輯課件PPT3蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)，在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。70可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的沉淀作用根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變（加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層）時(shí)，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不再穩(wěn)定并將發(fā)生沉淀作用(Precipitation)。沉淀法具有部分純化、濃縮特點(diǎn)。71可編輯課件PPT3蛋白質(zhì)的沉淀作用（1）可逆沉淀：在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去沉淀劑，可使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶液中。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。72可編輯課件PPT因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質(zhì)分離出來。可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。73可編輯課件PPT3蛋白質(zhì)的沉淀作用（2）不可逆沉淀：在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水，不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中，不能用透析等方法除去沉淀劑后使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶液中。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。74可編輯課件PPT使蛋白質(zhì)沉淀的試劑：1.高濃度中性鹽：（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl

這種加入鹽中和蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質(zhì)分離制備。2.有機(jī)溶劑：丙酮、乙醇

破壞蛋白質(zhì)水膜3.重金屬鹽：

Hg2+、Ag+、Pb+

與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)形成不易溶解的鹽4.生物堿試劑：苦味酸、三氯乙酸、目酸、鎢酸等

與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)生成不溶性鹽75可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的變性(denaturation)：在某些物理和化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，引起其理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生物活性喪失的現(xiàn)象。4、蛋白質(zhì)的變性76可編輯課件PPT

變性的本質(zhì)——破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

造成變性的因素?zé)?、紫外光、乙醇等有機(jī)溶劑、激烈的攪拌、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等。77可編輯課件PPT蛋白質(zhì)變性后的性質(zhì)改變：

變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。溶解度降低粘度增加結(jié)晶能力消失生物活性喪失易受蛋白酶水解78可編輯課件PPT

應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。豆腐的制作急救：中毒后灌豆?jié){、牛奶等煮熟食物方便消化防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

79可編輯課件PPT若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。80可編輯課件PPT

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性81可編輯課件PPT大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。5蛋白質(zhì)的紫外吸收82可編輯課件PPT6、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)83可編輯課件PPT研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)隨時(shí)測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。二、蛋白質(zhì)分離和純化84可編輯課件PPT(1)生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提酸性蛋白用稀堿性溶液抽提脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。1．蛋白質(zhì)的分離步驟85可編輯課件PPT沉淀法膜分離法萃取法層析法電泳法2．蛋白質(zhì)的純化方法86可編輯課件PPT*鹽析：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。陰離子化合物的效果是：NH4+>K+>Na+陽離子化合物的效果是：PO43->SO42->Cl-常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時(shí)所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。(1)沉淀法鹽析2．蛋白質(zhì)的純化方法87可編輯課件PPT在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強(qiáng)，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)生變性，有機(jī)溶劑濃度不能太高(30%-50%)，而且需要在低溫條件下進(jìn)行。(1)沉淀法—

有機(jī)溶劑沉淀法2．蛋白質(zhì)的純化方法88可編輯課件PPT(1)沉淀法—

等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的pH被調(diào)到某一成分的等電點(diǎn)時(shí)，則該蛋白質(zhì)大部或全部將沉淀出來。而那些等電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)仍然留在溶液中。該法適用于在等電點(diǎn)pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)2．蛋白質(zhì)的純化方法89可編輯課件PPT（2）膜分離法——

透析法Dialysis此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。2．蛋白質(zhì)的純化方法90可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行透析。通透動(dòng)力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。（2）膜分離法

透析法91可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過超濾膜。其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器板式超濾器。超濾膜的截止分子量有100萬、50萬、30萬、10萬、5萬、1萬、5千和1千（道爾頓，Dr）（2）膜分離法超過濾法92可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法超過濾法93可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法兩種親水性高分子或一種高分子聚合物與一種鹽溶液混合后，因疏水性差異而分層。不同的蛋白質(zhì)在疏水層的溶解能力不同而被萃取。目前主要采用兩種體系聚乙二醇－-葡聚糖聚乙二醇－-磷酸鉀（3）萃取法雙水相萃取法94可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法由于蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)、疏水性質(zhì)不同，用有機(jī)溶劑、表面活性劑、水構(gòu)成的反相膠束提取某些蛋白質(zhì)。將表面活性劑溶解于有機(jī)溶劑中，等體積加入到蛋白質(zhì)水溶液內(nèi)，混合后可使某些蛋白質(zhì)萃取到反相膠束內(nèi)。（3）萃取法反相膠束萃取法95可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa壓力下，CO2處于液體狀態(tài)，溫度為31.1°C，當(dāng)壓力或溫度發(fā)生改變時(shí)，CO2處于氣－液中間態(tài)，具有溶劑性能，可以使許多蛋白質(zhì)及有機(jī)物質(zhì)溶解在某一狀態(tài)。經(jīng)過泵出、升溫等步驟即可分離出來。（3）萃取法超臨界流體萃取法96可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法（3）萃取法超臨界流體萃取法97可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。帶正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。（4）層析法

離子交換層析法98可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法（4）層析法

離子交換層析法99可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法此法又稱為分子篩層析、分子排阻層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400（4）層析法

凝膠過濾法100可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法（4）層析法

凝膠過濾法101可編輯課件PPT102可編輯課件PPT103可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法利用蛋白質(zhì)表面存在的疏水區(qū)域的強(qiáng)度、大小不同，而被吸附到連接有疏水基團(tuán)的層析介質(zhì)上。離子強(qiáng)度增大可增強(qiáng)吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時(shí)可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進(jìn)行梯度洗脫。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose（4）層析法疏水層析104可編輯課件PPT2．蛋白質(zhì)的純化方法這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合能力。選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出