細(xì)胞生物學(xué)-細(xì)胞周期的調(diào)控

關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)-細(xì)胞周期的調(diào)控第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控

MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的調(diào)控第2頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用1Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela細(xì)胞為材料，發(fā)現(xiàn)M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即促細(xì)胞分裂因子(mitosis-promotingfactor，MPF)第3頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天------使間期細(xì)胞出現(xiàn)類(lèi)似于有絲分裂期的形態(tài)變化：染色質(zhì)凝集，核被膜破裂及核仁消失，將這種現(xiàn)象叫做染色體超前凝集(prematurechromosomecondensation)。將Hela細(xì)胞同步于不同階段，然后與M期細(xì)胞混合，在滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)下，誘導(dǎo)細(xì)胞融合。結(jié)果----第4頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天Meaning?

M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即細(xì)胞分裂促進(jìn)因子(mitosis-promotingfactor，MPF)。人M期細(xì)胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)PCC不僅同類(lèi)M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類(lèi)的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生。第5頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天非洲爪蟾卵細(xì)胞發(fā)育過(guò)程分為六個(gè)階段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期。前四個(gè)時(shí)期為卵母細(xì)胞生成和生長(zhǎng)階段。其中第Ⅳ期時(shí)細(xì)胞核較大，稱(chēng)為生發(fā)泡(germinalvesicle,GV)，此時(shí)細(xì)胞就停留在該時(shí)期，等待成熟。卵細(xì)胞提取物注射實(shí)驗(yàn)2促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）

第6頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天1971年，Masui和Markert在體外用孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾的卵母細(xì)胞成熟第7頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天Meaning?

：孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟；成熟卵細(xì)胞質(zhì)中，含有卵母細(xì)胞成熟的因子，即促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）

。用成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)注射到卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。第8頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天1988年Maller實(shí)驗(yàn)室的J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。3MPF的純化第9頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天4細(xì)胞周期基因的發(fā)現(xiàn)LelandHartwell

七十年代初，美國(guó)西雅圖的華盛頓大學(xué)LelandHartwell，

以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，利用阻斷在不同細(xì)胞周期階段的溫度敏感突變株，分離出了幾十個(gè)與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene，cdc)。他發(fā)現(xiàn)的一群基因，成為八十年代和九十年代人們研究細(xì)胞周期的主要對(duì)象。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M轉(zhuǎn)換點(diǎn)發(fā)揮重要的功能。第10頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

也在七十年代，英國(guó)牛津大學(xué)的PaulNurse，用另外一種酵母裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，同樣發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞周期調(diào)控基因，如：裂殖酵母cdc2；通過(guò)對(duì)它們的分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)cdc2和cdc28的都編碼一個(gè)34KD的蛋白激酶。這個(gè)酶的激活和失活調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，特別是G2/M期轉(zhuǎn)變。但研究者很快發(fā)現(xiàn)，p34cdc28

或p34cdc2單獨(dú)并不具有激酶活性，需要同相關(guān)蛋白結(jié)合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13結(jié)合）。第11頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天PaulNurse和美國(guó)科羅拉多大學(xué)的Maller合作證明（1990）證明P32實(shí)際上是CDC2的同源物。第12頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天13

1983年TimothyHunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過(guò)程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開(kāi)始合成，G2/M時(shí)達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，在下一個(gè)周期中又重復(fù)這一消長(zhǎng)現(xiàn)象，故命名為周期素或周期蛋白cyclin

。隨后cyclin很快被分離和克隆出來(lái)，證明其廣泛存在于從酵母到人類(lèi)等各種真核生物中，而且在功能上存在互補(bǔ)性。5細(xì)胞周期蛋白(cyclin)的發(fā)現(xiàn)第13頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天TimHunt和Maller合作證明P45是cyclinB的同源物，從而將細(xì)胞周期三個(gè)領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。PaulNurse(human-yeastgenes);TimHunt(cyclin)第14頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天●催化亞基活性有賴(lài)于周期蛋白，故蛋白稱(chēng)為周期依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,Cdks);●調(diào)節(jié)亞基：周期蛋白(cyclin)。MPF的結(jié)構(gòu)組成由兩個(gè)不同的亞基組成的異質(zhì)二聚體:第15頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天LelandH.Hartwell

R.Timothy(Tim)Hunt

2001年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家LelandHartwell和英國(guó)科學(xué)家蒂TimHunt

、PaulNurse

，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。第16頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、周期蛋白

自發(fā)現(xiàn)周期蛋白后，在不長(zhǎng)的時(shí)間里有數(shù)十種周期蛋白被克隆和分離。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎動(dòng)物的A1-2、B1-3

、C、

D1-3、E1-2、F、G、H等。周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合.M期G1期第17頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

cyclinbox：各類(lèi)周期蛋白均含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱(chēng)為周期蛋白盒(cyclinbox)，介導(dǎo)周期蛋白與CDK(cyclin–dependentkinase)結(jié)合。

Cyclin也含有降解盒（destructionbox）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－絲氨酸－蘇氨酸）序列，它可以通過(guò)定時(shí)降解或恒定地迅速周轉(zhuǎn)來(lái)調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的水平，起著CDK的調(diào)節(jié)亞基的作用。第18頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天已知30余種，在脊椎動(dòng)物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類(lèi)：G1型、G1/S型、S型、M型。不同類(lèi)型的CDK/cyclin復(fù)合體第19頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同周期蛋白的表達(dá)時(shí)期不同，與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同CDK激酶的活性。

部分哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關(guān)系。第20頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclindependentkinase)是指與周期蛋白結(jié)合才具有酶活性的激酶類(lèi)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10余種。

在細(xì)胞周期中，CDK的表達(dá)量相對(duì)恒定，但以非活性的形式存在，在細(xì)胞周期特定的時(shí)間與周期蛋白特異地結(jié)合，一種CDK能與多種cyclin結(jié)合，以復(fù)合體的形式發(fā)揮作用。四、CDK激酶和CDK激酶抑制物第21頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天CDKs是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，稱(chēng)為CDK1~9。第22頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

各種CDK分子在進(jìn)化上高度保守，都含有一段類(lèi)似的CDK激酶結(jié)構(gòu)域，其中一段PSTAIRE的序列相當(dāng)保守，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。另外，都有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，位點(diǎn)的磷酸化與激酶的活性有關(guān)。第23頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天這類(lèi)蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于細(xì)胞周期，包括DNA合成的啟動(dòng)和終止，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纖層的降解和重新聚合，紡綞體的形成和消失等。它們可根據(jù)作用的時(shí)期不同分為G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。第24頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天時(shí)相蛋白激酶周期蛋白G2→MCdk1周期蛋白A，BG1→SCdk2周期蛋白ESCdk2周期蛋白A?Cdk3?G1

Cdk4周期蛋白D1，D2，D3G1

Cdk5周期蛋白D1，D2，D3G1

Cdk6周期蛋白D1，D2，D3哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期蛋白與周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶第26頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天CDK催化活性的激活：①CDK與周期蛋白結(jié)合②保守蘇氨酸殘基磷酸化修飾CDK催化活性的抑制：①N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化②抑制蛋白與其結(jié)合(是主要的抑制性調(diào)節(jié))CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。CDK的調(diào)節(jié)物包括：cyclin、CKI、CDK調(diào)節(jié)分子、CAK和磷酸酶等。CDK的活性調(diào)節(jié)第27頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞中還具有細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子（CDK

inhibitor，CDKI）對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CDKI分為兩大家族：

①I(mǎi)nk4(Inhibitorofcdk4)，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，能專(zhuān)一性的與CDK4和CDK6結(jié)合，并阻止其與周期蛋白的結(jié)合反應(yīng)，從而特異地抑制CDK4-cyclinD1、CDK6-cyclinD1復(fù)合物的活性，使細(xì)胞停留于G1期。

細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子第28頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天P27—Cdkinhibitorproteins(CKIs)P27能與幾乎所有的cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其蛋白激酶活性，使細(xì)胞停留于G1期。其作用機(jī)制是抑制cyclinH-CDK7等CAK的活性。

②CIP/Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括P21cip/waf1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，第29頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控CDK激酶對(duì)細(xì)胞周期起著核心性的調(diào)控作用。不同種類(lèi)的周期蛋白和不同種類(lèi)的CDK結(jié)合,構(gòu)成不同的CDK激酶。不同的CDK激酶在細(xì)胞周期的不同時(shí)期表現(xiàn)出活性,因而對(duì)細(xì)胞周期的不同時(shí)期進(jìn)行調(diào)節(jié)。第30頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天Cdkassociatessuccessivelywithdifferentcyclinstotriggerthedifferenteventsofthecycle.Cdkactivityisusuallyterminatedbycyclindegradation.酵母細(xì)胞周期的調(diào)控第31頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的調(diào)控

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期受一個(gè)小型Cdks家族的調(diào)節(jié)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中起作用的Cdks,Cdk1、Cdk2、Cdk3…等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能表達(dá)多種周期蛋白:周期蛋白A、B、D和E。第32頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，G1期cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合（一）細(xì)胞周期的啟動(dòng)G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴(lài)性CDK激酶細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)化受G1期周期蛋白依賴(lài)性激酶所控制：

G1期激酶：CDK4、CDK6

G1期周期蛋白：cyclinD,E。cyclinD的合成對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子有強(qiáng)烈的依賴(lài)性第33頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天Rb是G1/S期轉(zhuǎn)化的負(fù)性調(diào)控因子,在G1晚期通過(guò)磷酸化而失活

Rb蛋白磷酸化→與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子（E2F）釋放→S期所需的基因轉(zhuǎn)錄的阻斷被解除→細(xì)胞進(jìn)入S期；使P-Rb被磷酸化而失活，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使促進(jìn)G1期轉(zhuǎn)入S期所需的調(diào)控基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后，cyclinD被磷酸化后泛素化途徑降解。第35頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天第36頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天周期蛋白E與CDK2結(jié)合，使之激活,使與RB類(lèi)似的蛋白質(zhì)底物p107

磷酸化而解除其對(duì)E2F的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。周期蛋白E在G1晚期表達(dá),進(jìn)入S期后降解.第37頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天第38頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天周期蛋白在CDK1激酶活性調(diào)節(jié)中的作用（二）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用

在G2-M期，cyclinB在細(xì)胞周期G2的中晚期逐漸積累，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化(如組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件)，使得細(xì)胞進(jìn)入M期。第39頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天CDK1激酶的激活促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期

在S期,Weel1活性高，可以促進(jìn)Thr14和Tyr15的磷酸化，Cdc25ｃ活性低。在Ｇ２期Cdc25ｃ活性增強(qiáng)，促進(jìn)Thr14和Tyr15的去磷酸化CAK=CDK1-ActivitingKinase第40頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞中CDK1激酶的活性受到多種因素的調(diào)控第41頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化絲氨酸和蘇氨酸），參與細(xì)胞的多種功能。第42頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天cyclinB/A與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件第43頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期轉(zhuǎn)化

細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)到中期后，M期周期蛋白A和B降解，CDK1激酶活性喪失，蛋白去磷酸化，由中期向后期轉(zhuǎn)化。

CyclingA和CyclinB都是經(jīng)依賴(lài)APC泛素化途徑所降解。第44頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天M期周期蛋白N端有破壞框。在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)一種未知的途徑，激活泛素酶復(fù)合物，將泛素連接在M期周期蛋白上，導(dǎo)致其被蛋白酶體降解.第45頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

泛素(Ubiquitin)是由76個(gè)氨基酸組成的一種小蛋白，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素。其主要功能是標(biāo)記需要降解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解。蛋白質(zhì)的泛素化主要發(fā)生在賴(lài)氨酸殘基的側(cè)鏈，且通常是多泛素化。結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別進(jìn)而被降解，泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被降解的標(biāo)簽。

26S蛋白酶體(proteasome)是一個(gè)由70多個(gè)亞基組成的大型復(fù)合分子，分子量接近2,000KD，可識(shí)別泛素化的蛋白質(zhì)，并將其降解成短肽。

泛素-蛋白酶體途徑第46頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天

需要被蛋白酶體降解的蛋白質(zhì)會(huì)先被連接上泛素作為標(biāo)記，這一過(guò)程是一個(gè)三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

★泛素活化酶E1(ubiquitinactivatingenzyme)

★泛素結(jié)合酶E2(ubiquitinconjugatingenzyme)

★泛素連接酶E3(ubiquitin-proteinligase)，也稱(chēng)底物識(shí)別因子(substraterecognitionfactor)。蛋白分子泛素化

由于蛋白酶體識(shí)別泛素化的蛋白并將其降解是一個(gè)非特異性的進(jìn)程，因此，E3在整個(gè)蛋白質(zhì)的降解過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，決定了反應(yīng)的特異性。第47頁(yè),共53頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.泛素的羧基端通過(guò)與泛素激活酶(E1)

的半胱氨酸殘基形成硫酯鍵而激活。2.泛素從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶(E2)

的半胱氨酸殘基。3.E2和泛素連接酶(E3)一起將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白的賴(lài)氨酸殘基,在那里進(jìn)行泛素的聚合化,最后作為