實(shí)驗(yàn)二-原代細(xì)胞培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解不同原代細(xì)胞的形態(tài)，掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備與培養(yǎng)方法。實(shí)驗(yàn)二

原代細(xì)胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細(xì)胞為例）ABA上皮細(xì)胞B成纖維細(xì)胞二、材料

1.9-12日齡雞胚

2.照蛋燈與蛋座

3.碘酊棉球與酒精棉球

4.大剪子、眼科剪、小鑷子

5.平皿、細(xì)菌瓶、吸管、吸球、細(xì)胞瓶

6.0.25%胰酶

7.基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM

生長液：含10%犢牛血清、200U/ml青霉素、200μg/ml鏈霉素的DMEM三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求

1）細(xì)胞密度

原代細(xì)胞：4-6×105個(gè)/ml

傳代細(xì)胞：2-3×105個(gè)/ml

2）pH范圍：最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3）培養(yǎng)溫度

四、操作步驟取9-12日齡孵育良好的雞胚，依次用碘酊和酒精消毒氣室部。無菌操作下用剪子去除氣室部卵殼和殼膜，穿破絨毛尿囊膜，夾住雞胚頸部，取出雞胚放于滅菌平皿中。用眼科剪、鑷去除雞胚頭、四肢及內(nèi)臟，用無血清的DMEM沖冼2次。將沖洗后的雞胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜狀。將剪碎的組織塊倒入細(xì)菌瓶中，加入5ml無血清DMEM，振搖幾次，靜置幾分鐘，吸棄洗液。如此重復(fù)1次。加5ml胰酶，在37℃水浴中消化20-30min，其間要不時(shí)搖動(dòng)，使細(xì)胞消化完全（組織塊變松散，沉降漸變緩慢時(shí)即表示消化足夠）。消化好后，取出瓶子，靜置幾分鐘，吸棄胰蛋白酶液。加DMEM生長液5ml，輕輕搖動(dòng)幾次后，靜置幾分鐘吸去。如此重復(fù)一次。加入生長液5ml，以粗口吸管吹吸數(shù)次，使細(xì)胞脫落分散，靜置幾分鐘，使未消化好的組織塊下沉。輕輕吸取上層細(xì)胞懸液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶約0.2-0.5ml，補(bǔ)加DMEM生長液至10ml，使細(xì)胞量約為4-6×105個(gè)/ml，蓋上蓋子，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

取細(xì)胞懸液0.5ml+2ml0.1%結(jié)晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37℃溫箱中5-10min，充分振蕩后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算4角4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。

每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n）