調(diào)節(jié)miR200c、ZEB1及TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)B16F10GPI-IL-21瘤苗抗黑色素瘤效應(yīng)的研究

調(diào)節(jié)miR200c、ZEB1及TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)B16F10/GPI-IL-21瘤苗抗黑色素瘤效應(yīng)的研究黑色素瘤是一種高度惡性腫瘤,占皮膚腫瘤死亡病例的極大部分,患者早期癥狀隱匿,一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,無(wú)法手術(shù)切除,故死亡率極高。隨著腫瘤免疫學(xué)的進(jìn)展,人們對(duì)腫瘤抗原、腫瘤免疫逃逸機(jī)制和腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識(shí)的深入,免疫治療逐漸成為腫瘤治療和研發(fā)領(lǐng)域的關(guān)注點(diǎn)：即通過(guò)激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力,從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞[2,3]。特別是近期抗PD-1和抗CTLA-4的單克隆抗體的應(yīng)用,在免疫治療黑色素瘤的療效方面有了突破性進(jìn)展[4-6]。細(xì)胞因子療法也是腫瘤免疫治療的一個(gè)重要途徑,即通過(guò)某種方式使需要的細(xì)胞因子水平增加,充分發(fā)揮某細(xì)胞因子抗腫瘤的生物學(xué)作用。大量的臨床數(shù)據(jù)表明,雖然免疫治療的應(yīng)用,使黑色素瘤的療效明顯提高,但仍有部分患者最后出現(xiàn)惡性復(fù)發(fā)[7-9]。治療失敗的原因之一是由于黑色素瘤細(xì)胞分泌大量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β),抑制了機(jī)體免疫功能,并促使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。IL-21是2000年發(fā)現(xiàn)的屬I(mǎi)L-2細(xì)胞因子家族的新成員,由活化的CD4+T輔助細(xì)胞產(chǎn)生,其受體表達(dá)在多種免疫細(xì)胞(B、T、NK細(xì)胞)上,因此對(duì)多種免疫細(xì)胞有重要的生物調(diào)節(jié)作用。IL-21能提高B淋巴細(xì)胞的增殖,提高IgG1的產(chǎn)生,從而調(diào)節(jié)人體體液免疫。IL-21還可增強(qiáng)NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的增殖與殺傷功能,從而增強(qiáng)人體的細(xì)胞免疫(圖1,圖2)。在腫瘤的免疫治療方面,無(wú)論是重組IL-21,還是表達(dá)IL-21的腫瘤疫苗,無(wú)論是單.藥治療還是聯(lián)合應(yīng)用,IL-21都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗腫瘤作用[12-14]。本實(shí)驗(yàn)組自2001年開(kāi)始從事IL-2的研究，并在國(guó)內(nèi)首次擴(kuò)增出小鼠的IL-21編碼基因，序列已于2003年遞交GeneBank(登錄號(hào)：AY428262)。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，IL-21在小鼠黑色素瘤等多種腫瘤中可誘導(dǎo)較強(qiáng)的抗腫瘤作用,黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21可增強(qiáng)免疫小鼠NK細(xì)胞和CTL的細(xì)胞毒功能,抑制Treg細(xì)胞及其對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用,同時(shí)增加T細(xì)胞分泌IFN-Y的能力；增加的IFN-γ具有直接抗腫瘤活性,并可減少TGF-β的表達(dá),進(jìn)而抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化,即Smad3和Smad4結(jié)合、Smad3的核內(nèi)積聚以及TGF-β應(yīng)答元件的活化,從而明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲性。然而,GPI-IL-21畢竟不能直接作用于TGF-3/Smad信號(hào)通路,因此不能完全阻斷黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。微小RNA(microRNA)是由基因組編碼的小分子RNA,長(zhǎng)度為22nt左右,由核內(nèi)和胞內(nèi)酶分別從折疊的發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄前體約為68個(gè)堿基RNA上切割形成,其功能發(fā)揮依賴(lài)于niRNA通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合到靶基因mRNA的3’UTR,通過(guò)抑制核糖體功能、降解靶基因mRNA等進(jìn)而調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯功能。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,上皮來(lái)源的腫瘤可借助EMT發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。黑色素瘤雖然不是上皮來(lái)源的,但瘤細(xì)胞具有上皮樣的特征,如易發(fā)生EMT而轉(zhuǎn)移。鋅指增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1(zinc-fingerE-boxbindinghomeobox1,ZEB1)是上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)轉(zhuǎn)錄抑制因子,具有典型的鋅指結(jié)構(gòu),可以和靶基因E-Cadherin啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合,抑制E-Cadherin的轉(zhuǎn)錄表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞間粘附性降低、移動(dòng)性和轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)。已有研究顯示,一方面miR200c能夠抑制ZEB1和ZEB2表達(dá),另一方而,ZEB1和ZEB2亦能在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR200c的表達(dá),專(zhuān)司上皮特性的miR200c和專(zhuān)司間質(zhì)特性的ZEB家族構(gòu)成了一個(gè)雙向反饋調(diào)節(jié)回路,在調(diào)控結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。此外,過(guò)表達(dá)miR200c可以阻斷TGF-β誘導(dǎo)的EMT。因此,這一領(lǐng)域研究成為腫瘤靶向治療關(guān)注點(diǎn)。以往研究顯示,細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等作為腫瘤瘤苗的免疫增強(qiáng)劑,僅限于其對(duì)免疫細(xì)胞的活化反應(yīng),但針對(duì)腫瘤細(xì)胞及其相關(guān)的信號(hào)通路的研究有限；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞本身的信號(hào)通路,從而影響其生物學(xué)特性,這對(duì)腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)所發(fā)揮的免疫治療作用有重要影響。由此我們?cè)O(shè)想,如果能直接下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá),并通過(guò)不同途徑調(diào)節(jié)miR200和ZEB1的表達(dá),可能會(huì)與黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21產(chǎn)生協(xié)同和增強(qiáng)作用。該策略應(yīng)用,一方而能提高機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊效應(yīng),另一方面能降低或阻止黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,從而發(fā)揮更好的抗腫瘤效果。為此,本論文進(jìn)行了如下系列實(shí)驗(yàn)研究。一.目的：通過(guò)調(diào)節(jié)miR200c、ZEB1及TGF-p1靶分子表達(dá),加強(qiáng)黑色素瘤B16F10/GPI-IL-21瘤苗的抗腫瘤效應(yīng),為腫瘤疫苗免疫治療黑色素瘤研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。二.方法：1.B16F10/GPI-IL-21瘤苗聯(lián)合miR200c和shZEB1的抗腫瘤效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制研究1)將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pSUPER-EGFP1-shZEB1(shZEB1)和pcDNA3.1/GPI-IL-21,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠B16F10細(xì)胞,G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆,分別命名為B16F10/shZEB1和B16F10/GPI-IL-21,并通過(guò)QRT-PCR和Western-blot鑒定靶分子表達(dá)；將過(guò)表達(dá)miR200c的核心質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G,通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染人胚腎HEK-293T細(xì)胞,回收上清,通過(guò)超高速離心法收集病毒并感染B16F10細(xì)胞,最后用極限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達(dá)miR200c的細(xì)胞株,命名為B16F10/miR200c,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定感染細(xì)胞中miR200c和ZEB1的表達(dá)；以野生型B16F10細(xì)胞為對(duì)照,通過(guò)Western-blot檢測(cè)B16F10/shZEB1、B16F10/GPI-IL-21和B16F10/miR200c中ZEB1、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Smad7等EMT相關(guān)分子的表達(dá),并用劃痕實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力和克隆形成能力；2)分別給予C57BL/6小鼠腹股溝處皮下接種絲裂霉素C(MMC,100μg/ml)滅活的B16F10/細(xì)胞1×107/只／周,在免疫后0、1、2、3、4周小鼠眼靜脈采血,雙抗夾心ELISA法檢測(cè)瘤苗免疫鼠血清中IFN-γ、IL-4和TGF-p的分泌,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；第3次免疫后1周將小鼠隨機(jī)分組,每組6只,分別于小鼠背部皮下攻擊野生株B16F10、B16F10/shZEB1、B16F10/GPI-IL-21和B16F10/miR200c細(xì)胞1×105/只,觀(guān)察皮下腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況以及小鼠的生存期等；HE染色比較各組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移情況,免疫組化和Western-blot檢測(cè)相應(yīng)腫瘤組織中EMT相關(guān)因子的表達(dá)情況。2shZEB1質(zhì)粒和miR200cagomir小鼠體內(nèi)接種以增強(qiáng)B16F10/GPI-IL-21瘤苗的抗黑色素瘤效應(yīng)及其機(jī)制研究1)小鼠免疫方法同前,第三次免疫結(jié)束后分別于小鼠背部皮下攻擊野生株B16F10細(xì)胞1×105／只,攻擊后3天,將小鼠隨機(jī)分三組,分別以PBS、shZEB1質(zhì)粒和miR200cagomir治療,4天／次×6；2)治療結(jié)束后小鼠眼靜脈采血,雙抗夾心ELISA法檢測(cè)瘤苗免疫鼠血清中IFN-y和TGF-p水平；處死部分小鼠,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組荷瘤鼠的NK和CTL細(xì)胞毒活性以及脾臟和腫瘤引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例；觀(guān)察皮下腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況以及小鼠的生存期等；HE染色比較各組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移情況,免疫組化和Western-blot檢測(cè)相應(yīng)腫瘤組織中EMT相關(guān)分子的表達(dá)。3.下調(diào)TGF-p1表達(dá)聯(lián)合miR200cagomir增強(qiáng)黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21的抗腫瘤效應(yīng)及其機(jī)制研究1)用pSUPER-EGFP1載體構(gòu)建針對(duì)小鼠shTGF-β1基因的干擾質(zhì)粒pSUPER-EGFP1-shTGF-β1(shTGF-p1),用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞,G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,并命名為B16F10/shTGF-β1,定量QRT-PCR檢測(cè)干擾效率,Western-blot檢測(cè)B16F10/shTGF-β1細(xì)胞中EMT相關(guān)分子的表達(dá)情況；通過(guò)克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其克隆形成能力、侵襲能力和遷移能力。2)按上述方法免疫小鼠,免疫后隨機(jī)分為B16F10/GPI-IL-21+B16F10/shTGF-β1組,(1×105B16F10/shTGF-β1細(xì)胞小鼠皮下成瘤),B16F10/GPI-IL-21+B16F10/shTGF-β1+miR200c組(1×105B16F10/shTGF-β1細(xì)胞小鼠皮下成瘤,同時(shí)以niR200cagomir治療),B16F10/GPI-IL-21+B16F10/Scrambled+miR200c/Scrambled組(1×105B16F10/Scramble細(xì)胞小鼠皮下成瘤,同時(shí)以miR200c/Scramble治療)；以?xún)山M未免疫鼠為對(duì)照,分別為B16F10/shTGF-β1組(1×105B16F10/shTGF-β1細(xì)胞小鼠皮下成瘤)、B16F10/shTGF-β1+miR200c組(1×105B16F10/shTGF-β1細(xì)胞小鼠皮下成瘤,并以miR200cagomir治療)。觀(guān)察各組小鼠腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、生長(zhǎng)速度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況以及小鼠的生存時(shí)間等；HE染色比較各組小鼠腫瘤的轉(zhuǎn)移情況,免疫組化和Western-blot檢測(cè)相應(yīng)腫瘤組織中EMT相關(guān)分子的表達(dá)。三.結(jié)果1)B16F10/GPI-IL21瘤苗免疫后,小鼠血清中IFN-γ、IL-4和TNFa的含量顯著升高,脾細(xì)胞的CTL毒性也明顯增強(qiáng),而TGF-p含量下降。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠的成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)速度以及肺轉(zhuǎn)移程度都明顯降低,小鼠的生存周期也顯著延長(zhǎng)。免疫組化和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織中TGF-p.ZEB1和N-Cadherin的表達(dá)都明顯降低,而E-Cadherin和Smad7的表達(dá)明顯增加,與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義。2)以B16F10/GPI-IL21瘤苗免疫小鼠后,用B16F10攻擊小鼠,再用shZEB1質(zhì)粒和niR200cagomir治療后,小鼠的NK和CTL細(xì)胞毒活性明顯增強(qiáng),腫瘤引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例顯著降低,小鼠的成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)速度和肺部轉(zhuǎn)移情況明顯下降,免疫組化和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,腫瘤組織中上皮相關(guān)分子表達(dá)量增加,而間質(zhì)表型的分子表達(dá)量下降,與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義。3)用下調(diào)TGF-β1表達(dá)的B16F10細(xì)胞攻擊B16F10/GPI-IL-21瘤苗免疫后小鼠,以miR200cagomir治療后顯示,該法誘導(dǎo)了更強(qiáng)的免疫反應(yīng),與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義。如增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞和CTL的細(xì)胞毒功能；更強(qiáng)的抑制Treg細(xì)胞的特異