細(xì)胞冷凍保存技術(shù)課件

動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法之細(xì)胞冷凍保存技術(shù)細(xì)胞冷凍保存技術(shù)細(xì)胞的低溫保存細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。目前，動物細(xì)胞一般保存于液氮中（-196℃）。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

一般在原代或傳代2－10次內(nèi)即大量凍存，作為原種（stockcells），取一支細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，用畢再凍存，這樣可保證長期使用和延緩衰老。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

根據(jù)細(xì)胞冷凍液在在凍結(jié)后是否形成冰晶，低溫冷凍保存細(xì)胞可分為：

1．非玻璃化冷凍

細(xì)胞在冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水形成冰晶。

2．玻璃化冷凍

細(xì)胞在冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水不形成冰晶，而是形成玻璃態(tài)。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)非玻璃化冷凍原則：緩慢冷凍原因：當(dāng)溫度降低到冰點以下時，細(xì)胞內(nèi)外的水分就會形成冰晶。細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷。這種損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。

細(xì)胞外的水形成冰晶后，使得未結(jié)冰的溶液中的

電解質(zhì)的濃度升高，細(xì)胞在這種高濃度的溶質(zhì)中時間過長，會使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)受到損害，細(xì)胞膜破裂，這種損害稱之為溶質(zhì)損傷。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶，從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞的損傷；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)在細(xì)胞凍存時加入冷凍保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。原理：1.常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，降低細(xì)胞的冰點2.提高胞膜對水的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷；解凍時，促進(jìn)細(xì)胞外水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，緩解滲透性腫脹。

3.稀釋細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中的電解質(zhì)，減少溶質(zhì)損傷。解決辦法：冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用細(xì)胞冷凍保存技術(shù)在培養(yǎng)液中添加的保護(hù)劑：二甲亞砜（Dimeethylsulfoide,DMSO），甘油,可使細(xì)胞免受低溫冰晶形成、及滲透壓改變而導(dǎo)致的物理損傷。預(yù)先配制凍存保護(hù)液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；細(xì)胞冷凍保存技術(shù)凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)凍存培養(yǎng)細(xì)胞(1)預(yù)保留細(xì)胞經(jīng)消化分散后，用將其預(yù)冷卻，4度取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1-5×106細(xì)胞/ml)；冷凍保護(hù)劑降溫時減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，以免對細(xì)胞造成傷害。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

(2)加入1ml細(xì)胞懸液于凍存管中，在火焰下將安瓿封口。密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期?？捎脦в?8G針頭注射器進(jìn)行分裝，如劑量過大，保護(hù)劑對細(xì)胞滲透作用不勻，冷凍效果不好。

(3)加保護(hù)劑的細(xì)胞懸液經(jīng)緩慢冷凍，結(jié)冰產(chǎn)生在細(xì)胞外(對細(xì)胞沒有損傷)。如果要長期保存，可以使用液氮罐，細(xì)胞冷凍保存技術(shù)(4)凍結(jié)好的安瓿放入低溫冰柜或液氮罐中。溫度達(dá)-150~-190℃，細(xì)胞幾乎處在停止?fàn)顟B(tài)。冷凍時帶手套操作，以免凍傷。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中細(xì)胞冷凍保存技術(shù)緩慢冷凍的簡化程序配置冷凍保護(hù)液在培養(yǎng)液中加入血清（一般20%）10%

甘油或

DMSO

將冷凍液加入離心管，使細(xì)胞濃度為

2~6×106cell/ml將冷凍液分裝到冷凍管中4℃冰箱放置30-60min-----20℃冰箱放置2小時（冷凍管放入泡沫盒或用棉花紗布包裹）-70℃冰箱放置1-2天投入液氮罐取旺盛生長的細(xì)胞,消化后用離心管離心回收細(xì)胞在沒有程序控制凍存器設(shè)備的條件下,細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)-196℃液氮罐普通冰箱低溫冰箱細(xì)胞冷凍保存技術(shù)解凍程序原則：快速解凍原因：解凍緩慢時，原有冰晶溶化后，又會以新的晶核為中心形成更大的冰晶，稱為水的重結(jié)晶現(xiàn)象。但采用快速解凍可避免水分的重結(jié)晶減少冰晶損傷。解凍程序：從液氮中取出冷凍管，快速放入37℃-

40℃水浴中，輕輕震搖，使凍存細(xì)胞盡快解凍（40-60s).

細(xì)胞冷凍保存技術(shù)玻璃化冷凍原則：快速冷凍原因：從理論上講，只要獲得足夠快的降溫速度，任何液體都可以進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。例如：要是純水進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，降溫速度需高達(dá)

1010

℃/s，以現(xiàn)在的條件沒辦法達(dá)到。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)解決辦法：通過添加高濃度的冷凍保護(hù)劑，可以顯著降低形成玻璃化所要求的降溫速度。一般冷凍保護(hù)劑的濃度為40%-60%。冷凍保護(hù)劑：DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇等。細(xì)胞冷凍保存技術(shù)玻璃化冷凍的程序配置冷凍液在平衡鹽溶液（Hanks）中加20.5%DMSO(w/v)15.5%乙酰胺(w/v)

、10%丙二醇和10%聚乙二醇。（以單核細(xì)胞為例）細(xì)胞冷凍保存技術(shù)取旺盛生長的細(xì)胞，消化后用離心管離心回收細(xì)胞，并將離心管置于冰浴中將預(yù)冷的冷凍液緩慢地滴加到離心管中，使細(xì)胞濃度為1-1.5×106cell/ml。（滴加的速度先慢后快，具體過程如下:前3分鐘以0.3ml/min滴加；后5分鐘以0.6ml/min滴加；余下的以0.75ml/min滴加）將含有細(xì)胞的冷凍液分裝到冷凍管中將冷凍管投入液氮細(xì)胞冷凍保存技術(shù)-196℃液氮罐細(xì)胞冷凍保存技術(shù)解凍程序從液氮中取出冷凍管放入冰浴中5min，使其融凍轉(zhuǎn)移到離心管，并放入冰浴中將已在冰浴中預(yù)冷的含20%血清的Hanks液對細(xì)胞凍存懸液稀釋。（稀釋過程要緩慢，具體過程如下：前10分鐘0.2ml/min速度滴加；接下來10分鐘以0.5ml滴加；接下來的15分鐘以0.75ml/min滴加；最后30min以1ml/min滴加）離心回收細(xì)胞，棄上清，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞冷凍保存技術(shù)細(xì)胞冷凍保存技術(shù)細(xì)胞冷凍保存技術(shù)細(xì)胞