豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)orexinb的分布定位

豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)orexinb的分布定位

或飼養(yǎng)因子，也稱為hykorcin，在1998年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)物理學(xué)，包括易感染a和易感染b。OrexinA是含有33個(gè)氨基酸殘基的多肽,并有2個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵,N端是焦谷氨酸殘基,C端酰胺化;而OrexinB是含有28個(gè)氨基酸殘基的線性多肽。OrexinA和OrexinB有46%的同源性,并且它們?cè)贑端高度保守。2種Orexin都能激活兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體-Orexin受體1(OX1R)和受體2(OX2R),其中OX2R與OrexinA和OrexinB具有相似的親和力,而OX1R與OrexinA的親和力比其與OrexinB的親和力高100～1000倍。Orexins通過其受體發(fā)揮作用,對(duì)動(dòng)物的攝食、能量平衡、睡眠和覺醒、神經(jīng)內(nèi)分泌、生殖活動(dòng)等均有一定的影響。Orexin神經(jīng)元在腦內(nèi)主要分布于下丘腦,而且在不同種屬的動(dòng)物其分布存在一定的差異,OrexinA與OrexinB的分布也有一些差異。本研究室已對(duì)豬腦內(nèi)OrexinA的分布定位做了研究,但豬腦內(nèi)OrexinB的分布定位尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元在豬腦內(nèi)的分布進(jìn)行了研究,旨在比較兩種Orexin分布的差異,為深入研究OrexinB調(diào)控動(dòng)物攝食、生殖等生理活動(dòng)的機(jī)理提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1月齡健康蘇鐘豬10頭,公母各5頭,購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘇鐘豬種豬場。1.2吉泰科技有限公司OrexinB抗血清(SantaCruzBiotechnologyInc,編號(hào)SC-8071),購自上海吉泰科技有限公司。SABC免疫組化染色試劑盒(批號(hào)SA1023)包括正常兔血清、封閉液、二抗(兔抗山羊IgG)、SABC(鏈酶親和素—過氧化物酶復(fù)合物),DAB顯色試劑盒(批號(hào)AR1022)和Polylysine(批號(hào)AR0003)購自武漢博士德生物工程有限公司。1.3灌注多聚甲醛/0.1mol/pbs固定液經(jīng)腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(5mL/kg)麻醉蘇鐘豬,手術(shù)暴露心臟,經(jīng)左心室先灌注500mL生理鹽水,再灌注4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS固定液。固定后取出腦和脊髓,置同一固定液中后固定4～6h。1.4冰激凌切片制備固定好的組織塊經(jīng)0.1mol/LPBS充分洗滌后,放入20%蔗糖/0.1mol/LPBS溶液中,置4℃待其下沉后作冰凍切片。片厚20μm,裱貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上,室溫干燥后置-20℃冰箱備用。1.5u3000家兔的免疫組化切片經(jīng)37℃恒溫箱干燥3h,按以下程序進(jìn)行反應(yīng):切片先經(jīng)蒸餾水洗滌5min;用新鮮配制的0.5%H2O2/甲醇溶液室溫處理30min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗滌3次;滴加正常兔血清封閉液,室溫作用20min后甩去多余液體;滴加一抗(山羊抗OrexinB多克隆抗體),置4℃冰箱過夜,37℃復(fù)溫1h,PBS洗滌2min×3次;滴加二抗(生物素化兔抗山羊IgG),37℃孵育20min,PBS洗滌5min×3次;滴加SABC,37℃作用20min,PBS洗滌5min×3次;滴加DAB,室溫顯色,約10min后鏡檢染色程度;蒸餾水洗滌終止反應(yīng),晾干,中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)染色對(duì)照:用PBS代替第一抗體,其它步驟不變。1.6sb2cd-pcr神經(jīng)元/纖維分布檢測有OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維分布的每個(gè)核團(tuán)選取5個(gè)典型切面,用明視野顯微鏡OlympusBH22獲取OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維的分布圖像,采用Image-ProPlus10.0軟件進(jìn)行分析。依據(jù)標(biāo)記神經(jīng)元的數(shù)目劃分為稀少(20～50個(gè)神經(jīng)元)、中等(51～100個(gè)神經(jīng)元)和密集(多于100個(gè)神經(jīng)元)。依據(jù)標(biāo)記纖維的稠密程度也劃分為稀少、中等和稠密幾個(gè)等級(jí)。2免疫陽性神經(jīng)元結(jié)果表明,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維分布于豬下丘腦、腦干和脊髓。在斜角帶、隔區(qū)和終紋床核也有密集的OrexinB免疫陽性纖維分布。免疫陽性神經(jīng)元胞體形態(tài)多樣,胞質(zhì)內(nèi)有棕紅色顆粒沉著,胞核內(nèi)無紅色顆粒沉著(圖1,D、F)。對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果為陰性。2.1免疫陽性神經(jīng)元/缺少拉格朗日算法orexinb在下丘腦,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元主要分布于視前區(qū)、室旁核、室周核、后區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、外側(cè)區(qū)、穹隆周核、未定帶、乳頭體核、腹內(nèi)側(cè)核和視交叉上核等部位,其中以穹隆周區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、未定帶和后區(qū)的OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布較密集,而視前區(qū)和視交叉上核的OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布較少。各核團(tuán)詳細(xì)分布如下:視前區(qū)免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量較少,散在分布,神經(jīng)元胞體較小,突起明顯,多呈雙極和多極形(圖1C)。視交叉上核免疫陽性神經(jīng)元零星分布,胞體呈梭形和卵圓形,多為單、雙極神經(jīng)元。下丘腦室旁核和外側(cè)區(qū)免疫陽性神經(jīng)元分布中等密集,胞體較大,多為卵圓形,突起明顯,多呈雙極和多極形。下丘腦背側(cè)區(qū)免疫陽性神經(jīng)元分布密集,胞體較大,多為圓形或紡錘形的雙極神經(jīng)元(圖1,D、E)。未定帶免疫陽性神經(jīng)元較密集,胞體較大,多呈紡錘形(圖1D)。穹隆周核OrexinB免疫陽性神經(jīng)元圍繞穹隆分布,較密集,胞體較大,突起明顯,多為三角形(圖1A、B)。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、乳頭體上核和結(jié)節(jié)乳頭體核散在少量OrexinB免疫陽性神經(jīng)元(圖1F)。2.2腦到延髓的核團(tuán)在腦干,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布于從中腦到延髓的許多核團(tuán),包括藍(lán)斑、前庭神經(jīng)核、下橄欖核、疑核和孤束核(圖2,B、C)。在孤束核,OrexinB陽性神經(jīng)元主要分布于外側(cè)亞核(圖2B)。2.3或exinb陽性器的骨髓分布在脊髓,僅見少量OrexinB免疫陽性神經(jīng)元,分布于頸部脊髓背角第Ⅳ層(圖2A)。2.4不同密度和密度下orexinb免疫陽性纖維分布分布OrexinB免疫陽性纖維為棕褐色,長短不一,多呈彎曲的波浪狀,有的纖維上有膨體,粗細(xì)不一,呈串珠狀,在前腦、間腦、腦干和脊髓內(nèi)廣泛分布。在間腦,大量的OrexinB免疫陽性纖維密集分布于隔區(qū)(圖2F)和終紋床核,較低密度的陽性纖維分布于大腦皮質(zhì)、杏仁核和海馬。在下丘腦,OrexinB免疫陽性纖維廣泛分布,在視前區(qū)、視交叉上核、視上核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和未定帶免疫陽性纖維分布較少,但在弓狀核、正中隆起、結(jié)節(jié)乳頭體核和乳頭體上核分布密集。在中腦,中央灰質(zhì)(圖2D)、中縫核、腳間核OrexinB免疫陽性纖維分布密度中等,而在黑質(zhì)、頂蓋和整個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)免疫陽性纖維分布較稀少。在腦橋,密集的OrexinB免疫陽性纖維分布于藍(lán)斑(圖2C)。在延髓,孤束核、迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核和第四腦室底(圖2E)有中等密度的OrexinB免疫陽性纖維分布。在脊髓,OrexinB免疫陽性纖維分布于各個(gè)節(jié)段,大量的陽性纖維分布于脊髓背側(cè)角,中等密度的陽性纖維分布于中央管周圍的灰質(zhì)(板層X)。3討論3.1orexinb在髓內(nèi)分布的分布自1998年發(fā)現(xiàn)Orexin以來,研究人員用免疫組化和原位雜交等方法研究發(fā)現(xiàn),在人、鼠、綿羊、雞、猴、兔、蛙和魚腦內(nèi),Orexin免疫陽性神經(jīng)元主要位于下丘腦,并發(fā)出纖維投射到整個(gè)腦區(qū),參與多種生理功能的調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)中未見有關(guān)豬OrexinB分布定位的報(bào)道。筆者用免疫組化法研究了豬腦和脊髓內(nèi)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維的分布定位。結(jié)果顯示,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維在下丘腦、腦干和脊髓均有分布,在下丘腦,陽性神經(jīng)元和纖維分布于視前區(qū)、視交叉上核、室旁核、室周核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、乳頭體核、外側(cè)區(qū)和后區(qū),其中以穹隆周區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、未定帶和下丘腦后區(qū)分布較密集,以視前區(qū)、視交叉上核、下丘腦外側(cè)區(qū)和乳頭體核分布較稀少。在腦干,陽性神經(jīng)元分布于藍(lán)斑、前庭神經(jīng)核、下橄欖核、孤束核和疑核。在脊髓,陽性神經(jīng)元較少,主要分布于頸部脊髓背角第Ⅳ層。此外,在斜角帶、隔區(qū)、終紋床核等部位觀察到密集的陽性纖維分布。本文結(jié)果與在人和其他動(dòng)物上的報(bào)道既有相似之處也有差異。在蛙,Orexins免疫陽性神經(jīng)元主要分布在視交叉上核、視前區(qū)以及第三腦室周圍;在雞,Orexins免疫陽性神經(jīng)元主要分布在室周核和下丘腦外側(cè)區(qū);在鼠,Orexins細(xì)胞體主要集中在下丘腦外側(cè)區(qū)、穹隆周區(qū)、背內(nèi)側(cè)核和下丘腦后區(qū),但在其他腦區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)免疫陽性神經(jīng)元。在綿羊,Orexins免疫陽性神經(jīng)元主要分布于下丘腦背內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)區(qū)、未定帶和穹隆周區(qū),少數(shù)位于下丘腦前區(qū)。在兔,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布于下丘腦的室旁核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、外側(cè)區(qū)和后區(qū)以及底丘腦的未定帶,以下丘腦背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核和外側(cè)區(qū)的陽性神經(jīng)元數(shù)量較多,下丘腦室旁核、后區(qū)和未定帶較少。此外,文獻(xiàn)報(bào)道OrexinB免疫陽性神經(jīng)元在延髓極后區(qū)有分布,本研究在豬極后區(qū)未見免疫陽性細(xì)胞。本試驗(yàn)在孤束核和藍(lán)斑發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞,但文獻(xiàn)中未見報(bào)道。筆者在脊髓發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞和纖維,文獻(xiàn)中也有采用高效液相法發(fā)現(xiàn)在脊髓存在OrexinB的報(bào)道。OrexinB免疫陽性纖維遍布整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng),與已報(bào)道的Orexins的分布基本一致。上述不同種屬動(dòng)物之間Orexin分布定位的相似性反映了Orexins在進(jìn)化上的保守性,至于差異性是由于試驗(yàn)中使用的抗體和方法的不同所致還是確實(shí)存在種屬間差異,還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)OrexinA在豬體內(nèi)的分布定位進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)OrexinA免疫陽性神經(jīng)元分布于下丘腦的視前內(nèi)側(cè)區(qū)、室周核、室旁核、視上核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、乳頭體核、前區(qū)、外側(cè)區(qū)和后區(qū)等部位,以下丘腦外側(cè)區(qū)、乳頭體核和視上核出現(xiàn)的免疫陽性神經(jīng)元最多。與OrexinA的分布相比較,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元的分布位點(diǎn)更為廣泛,但其在各核團(tuán)的密度不如OrexinA的大。豬體內(nèi)2種Orexin分布的差異提示其功能上可能存在差異,有待深入研究。3.2其他/對(duì)攝食的調(diào)節(jié)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的廣泛分布表明其參與多種生理功能的調(diào)節(jié),包括攝食、能量平衡、睡眠與覺醒、生殖、應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌等活動(dòng)。許多文獻(xiàn)報(bào)道Orexins主要集中在下丘腦外側(cè)區(qū),因此參與攝食的調(diào)節(jié)。給鼠腦室注射OrexinA對(duì)攝食有明顯的刺激作用。給綿羊腦室注射OrexinB,其調(diào)節(jié)攝食的作用只在短期內(nèi)有效。但給豬在外周注射OrexinB,對(duì)攝食的影響與對(duì)照組相比較差異不顯著。豬下丘腦外側(cè)區(qū)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元的分布不如OrexinA密集,也可能與此有關(guān)?？梢奜rexinB對(duì)攝食的調(diào)節(jié)作用可能較微弱。視前區(qū)和下丘腦前區(qū)是GnRH分布密集的區(qū)域,參與LH釋放的調(diào)節(jié)。有報(bào)道表明未定帶參與生殖功能的調(diào)節(jié),起源于這個(gè)區(qū)域的多巴胺、黑色激素凝集素神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)能刺激LH的分泌。OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維分布