絲蟲病特異性IgG4檢查方法 課件

絲蟲特異IgG4試劑盒檢測方法1一、ELISA介紹2ELISA是酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbent

Assay）的簡稱，是在免疫酶技術(shù)上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術(shù)。屬固相酶免疫測定技術(shù)。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自20世紀70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。二、ELISA原理3抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體,再加相應(yīng)酶標記抗體，生成抗原--待測抗體--酶標記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。待測抗體的量與有色產(chǎn)物成正比。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。同理也可包被抗體，測定抗原含量。間接法4(測定抗體)夾心法(測定抗原)競爭法(測定抗原)三、ELISA常用方法間接法5A.將抗原吸附于固相載體表面C.加酶標抗體B.加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物D.加底物。測定底物的降解量＝抗體量。夾心法6A.將抗體吸附于固相表面C.加酶標抗體B.加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物D.加底物。底物的降解量＝抗原量A.將抗體吸附在固相載體表面7競爭法B.加入酶標抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；對照只加入酶標抗原C.加底物。對照孔與

樣品孔底物降解量

的差＝未知抗原量。對照樣品四、檢測特異IgG4亞類抗體的優(yōu)點18機體感染絲蟲后，血清中特異IgG4抗體顯著

升高，并且IgG4抗體是一個短程抗體，當感染的病原體被機體清除后，IgG4抗體迅速降低或消失。因此，檢測IgG4可以用于診斷和療效考核。四、檢測特異IgG4亞類抗體的優(yōu)點29鱗酸膽堿（PC）和多糖蛋白（GAC）是多種寄生蟲所共有的抗原成分，是重要的交叉反應(yīng)原。IgG（

IgG1、IgG2、IgG3）抗體分子的可變區(qū)具有結(jié)合（PC）和（GAC）抗原決定蔟的部位，因此檢測總IgG時，多種寄生蟲之間常發(fā)生交叉反應(yīng)。由于IgG4抗體分子可變區(qū)沒有結(jié)合PC和GAC的結(jié)構(gòu)，故檢測特異IgG4，不易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。四、檢測特異IgG4亞類抗體的優(yōu)點310另外，該試劑盒不僅能檢測血清，還可檢測濾紙血樣，因此該試劑盒特別適合流行病學調(diào)查和疾病檢測。五、試劑盒的組成1.

絲蟲抗原包被板96T2.

反應(yīng)終止液10ml/瓶3.

抗人IgG4酶結(jié)合物10ml/瓶4.

陰性對照1支5.

洗滌劑干粉2袋6.

陽性對照1支7.

底物稀釋液12ml/瓶8.

使用說明書1份9.

底物干粉1支絲蟲IgG4抗體酶免檢測試劑盒酶免檢測試劑盒11山東省寄生蟲病防治研究所和深圳市康百得生物科技有限公司聯(lián)合研制六、樣本采集12血清：采受檢者靜脈或末梢血，離心后收集血清。在低溫下運送，4℃保存，-20℃可長期保存。濾紙血：以皮膚消毒劑消毒耳垂(或指端)待干，用一次性采血針快速深刺，以潔凈濾紙(約長6～8cm、寬2cm)沾取自然流出的一滴耳垂或手指血(約20μl)，血斑直徑應(yīng)在1.2cm，并要求浸透濾紙，每個受檢者采制濾紙血2個血膜，自然干燥后用塑料袋密封置

4℃保存（可保存約6個月，樣本可常溫郵寄）。濾紙血血膜制作示意圖6cm直徑1.2cm(復(fù)核用)2cm編號直徑1.2cm(檢測用)13七、操作14（一）將每袋洗滌劑干粉用500ml蒸餾水溶解作反應(yīng)板洗滌液和樣品稀釋液用。血清樣本按1：40稀釋，濾紙血樣本按直徑1.1cm圓片加400μl樣本稀釋液，37℃浸泡2小時(或4℃過夜)稀釋處理。（二）取已稀釋的樣本100μl加入反應(yīng)板孔內(nèi)，同時設(shè)陰性、陽性對照（陰、陽性對照已稀釋，直接加入100μl）及空白

對照（加100μl樣本稀釋液）各1孔，37℃反應(yīng)90分鐘后甩去孔內(nèi)液體，用洗滌液加滿各孔，靜置30秒后甩去，共洗5次，最后一次拍干。七、操作15（三）除空白對照孔外每孔加抗人IgG4酶結(jié)合物2滴，37℃反應(yīng)90分鐘后甩干孔內(nèi)液體。同上洗滌。（四）將底物干粉完全溶解于底物稀釋液中(底物溶解后

4℃避光可保存1周)，各孔加入底物溶液2滴，37℃反應(yīng)30分鐘后加1滴終止液終止反應(yīng)，混勻，觀察結(jié)果。操作圖16八、結(jié)果判斷17（一）肉眼觀察：當陰性對照孔無色或顯微黃色，陽性對照孔呈明顯黃色時，試驗有效。待檢樣品孔顏色呈明顯深于陰性對照的黃色即判為陽性。（二）儀器檢測：應(yīng)用酶標儀以空白對照孔調(diào)零，在波長

405nm處讀取各孔OD值。以樣本OD≥陰性對照OD值的2.1倍為陽性，若陰性對照OD值不足0.07，按0.07計算。九、注意事項18檢測盒應(yīng)置于4℃可保存6個月，取用時平放于實驗臺恢復(fù)至 室溫后使用。底物溶解后不能長期保存應(yīng)盡快用完。肉眼判斷結(jié)果不太鮮明，最好以酶標儀測OD值來判斷結(jié)果。血清樣本要長期保存時須置于-20℃，濾紙血樣本于4℃可保 存6個月左右。終止液有腐蝕性，應(yīng)避免與皮膚接觸。絲蟲特異性IgG4檢測與病原學血檢結(jié)果比較檢測對象絲蟲特異性IgG4檢測病原學血檢檢測人數(shù)陽性人數(shù)陽性率(％)檢測人數(shù)微絲蚴血癥數(shù)微絲蚴率(％)原微絲蚴血癥轉(zhuǎn)陰者76007600消除絲蟲病地區(qū)居民6922.96900消除絲蟲病后出生的兒童14300___非絲蟲病流行區(qū)兒童20000___象皮腫200200乳糜尿100100急性淋巴管炎100100其他寄生蟲病2900___湖南段績輝應(yīng)用絲蟲特異性IgG4檢測試劑盒在湖南省消除絲蟲病地區(qū)的監(jiān)測研究結(jié)果1920幾種不同人群絲蟲病IgG4檢測結(jié)果對象IgG4抗體病源學血檢檢測人數(shù)陽性人數(shù)陽性率（%）血檢人數(shù)陽性人數(shù)陽性率（%）原微絲蚴血癥轉(zhuǎn)陰者34361.7534700基本消滅絲蟲病后出生兒童54200000縱向監(jiān)測點人群7779.097722.59合

計962131.35417