上海市雙殼貝類污染的初步調(diào)查

上海市雙殼貝類污染的初步調(diào)查

近年來，隨著水體富營養(yǎng)化的加劇，赤潮的爆發(fā)給全球生態(tài)帶來了嚴(yán)重危害。引發(fā)赤潮的有毒藻類分泌的赤潮藻毒素能夠在海水貝類體內(nèi)的消化腺富集。影響我國食品安全的藻毒素主要為鰭藻屬(Dinophysis)分泌的腹瀉性貝毒(diarrlleticshellfishpoisoning,DSP)。其中,大田軟海綿酸(okadaicacid,OA)及其天然衍生物鰭藻毒素(dinophysistoxins,DTXs)是腹瀉性貝毒的主要致病毒素,結(jié)構(gòu)如圖1。OA是一種脂溶性物質(zhì),不溶于水,熔點為134℃,對于一般性的加熱烹調(diào)處理仍較穩(wěn)定,所以腹瀉性貝毒引起的食物中毒事件時有發(fā)生。OA通過影響Na+、Ca2+濃度而引起腸道炎癥,中毒癥狀為腹瀉、惡心、嘔吐。目前雖然沒有腹瀉性貝毒中毒導(dǎo)致的死亡的事件,但是OA被認為是一類潛在的腫瘤促進因子,可能具有遺傳毒性。目前常用來檢測DSP的方法有小鼠生物檢測法(MBA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和儀器分析法(如高效液相色譜法HPLC,MC-MS/MS)[3,12,13,14,15,16,17,18]。小鼠生物檢測法(MBA)雖然是由美國分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)推廣為DSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,但由于近年來國際上對于實驗動物福利的提升以及其自身的不可重復(fù)性及較高的假陽性,限制了該方法在檢測中的應(yīng)用。ELISA方法是常見的免疫學(xué)檢測方法,但目前國內(nèi)還沒有商品化的檢測試劑盒,價格昂貴同時具有較高的交叉反應(yīng)率。HPLC雖然靈敏準(zhǔn)確且能確定各種毒素成分,但該方法需要昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)維護和特定條件的摸索,也限制了其在室外檢測的應(yīng)用。免疫膠體金技術(shù)是一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù),以膠體金作為示蹤標(biāo)記物,應(yīng)用于特異性抗原抗體反應(yīng)。氯金酸(HAuCl4)水溶液在還原劑的作用下,聚合成特定大小的金顆粒,帶負電且疏水,在靜電作用下成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),稱為膠體金。膠體金顆粒在弱堿性環(huán)境中帶負電荷,可以與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團結(jié)合。由于膠體金顆粒本身呈紅色,所以當(dāng)免疫膠體金顆粒遇到相應(yīng)的抗原或抗體時會發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生聚集,在適宜條件下達到一定的密度,出現(xiàn)肉眼可見的紅色,因而在定性或半定量的快速免疫檢測方法中得到了廣泛的應(yīng)用。隨著人們對食品安全和海洋環(huán)境監(jiān)測的日益重視,迫切需要一種快速穩(wěn)定的檢測貝類體內(nèi)毒素的方法。本實驗室根據(jù)自行制備的抗OA單克隆抗體,經(jīng)純化后,制備膠體金標(biāo)記抗OA單抗,即將金標(biāo)單抗(膠體金標(biāo)記OA單抗)進行包被,噴于M135硝酸纖維素膜上,組裝成OA免疫膠體金試紙條,旨在較好地應(yīng)用雙殼貝類腹瀉性貝毒的檢測。1材料和方法1.1樣品的采集和運輸自2011年5月至2011年10月,每月從上海水產(chǎn)品市場采集貝類樣品,6個月共采集貝類樣品69份,主要種類為海灣扇貝(Argopectenirradians)、近江牡蠣(Crassostrearivularis)、貽貝(Mytilus)、雜色蛤仔(Ruditapesvariegata)、文蛤(Meretrixmeretri)、縊蟶(Sinonovaculaconstrzcta)等。樣品采集后,當(dāng)場用干凈的海水沖洗干凈貝類外殼表面的泥沙,放入采樣袋,冷凍運輸至實驗室,-20℃保存。樣品采集地點,見圖2。1.2方法1.2.1免疫膠體金分布及線型篩選將樣品在室溫下解凍,取出消化腺,置于紗布上,濾干水分后,經(jīng)高速組織勻漿儀勻漿,取1g組織勻漿置于10mL離心管中,加入2mL80%(V/V)甲醇,混勻后,4000r/min離心10min。取上清,向沉淀中再加2mL80%甲醇,混勻后離心,合并兩次所取上清。加入等體積的正己烷脫脂,除去正己烷,加入4mL氯仿萃取,萃取液于40℃水浴、氮氣流中吹干。殘余物用色譜純甲醇溶解,定容至1mL(相當(dāng)于1g消化腺/mL溶解液)。然后高速離心(10000r/min,10min)取上清作為供試液用于免疫膠體金試紙檢測。將試紙條從4℃冰箱中取出后須在室溫中放置30min后啟封,檢測卡平放,滴加3滴處理過的提取液,每份樣品3個平行,3-5min內(nèi)觀察結(jié)果。檢測線(T線)不顯色,控制線(C線)顯色,為陽性;檢測線(T線)顯色,控制線(C)線顯色,為陰性。1.2.2ua蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將1g消化腺經(jīng)兩次甲醇抽提,過濾稀釋,取100μL進行分析。室溫條件下,在酶標(biāo)板中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品,每個樣品2個平行;加入50μL稀釋的OA-HRP;再加入50μLOA抗體溶液,用封口膜覆蓋,輕微震蕩30s;室溫下孵育1h;倒出孔中液體,將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中液體;用250μL洗液充入孔中,再次倒出孔中液體,并拍打完全除去液體,重復(fù)洗板操作2次;加入150μL底物溶液到每一孔中,充分混合并在室溫下避光孵育30min;迅速加入100μL終止液,混勻,15min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測吸光度(450nm),按照上述步驟,以0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出樣品中OA的含量。2結(jié)果2.1表1表2表2免疫膠體金試紙條共檢測出11份樣品含有OA,檢出率為15.9%(表1)。這些樣品為貽貝(5份)、扇貝(4份)、牡蠣(1份),黃泥螺(1份)。其中有6份樣品的檢測線顏色為淡紅色,為花蛤(2份),牡蠣(1份),扇貝(1份),毛蚶(1份),扇貝(1份)。2.2膠體金檢測結(jié)果對69份樣本進行ELISA測定,共發(fā)現(xiàn)21份陰性樣品(OA含量<5μg/100g貝肉),48份陽性樣品(OA含量>5μg/100g貝肉),結(jié)果見圖3。11份膠體金陽性樣品均含有OA,其含量為15.29μg/100g貝肉、15.73μg/100g貝肉、16.26μg/100g貝肉、17.51μg/100g貝肉、18.29μg/100g貝肉、21.53μg/100g貝肉、22.60μg/100g貝肉、23.67μg/100g貝肉、28.92μg/100g貝肉、38.21μg/100g貝肉、41.92μg/100g貝肉,均高于膠體金檢測試紙的檢測限15μg/100g貝肉,膠體金檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果吻合率為100%。膠體金陰性樣品中,有4份樣品的ELISA檢測結(jié)果介于16.84-18.30μg/100g貝肉之間。3結(jié)果分析和應(yīng)用根據(jù)膠體金免疫層析原理制成的檢測試紙,被認為是當(dāng)前實現(xiàn)快速簡易檢測靶目標(biāo)的有效途徑之一,目前免疫膠體金層析技術(shù)已成功應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害的早期診斷、快速檢測水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留等領(lǐng)域中。本次試驗應(yīng)用OA膠體金試紙條測出來的11份陽性樣本,經(jīng)ELISA方法證實均含有OA,沒有假陽性存在。本次檢測結(jié)果的污染種類及測定結(jié)果,與相關(guān)報道吻合,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,特異性高,穩(wěn)定性較好。與小鼠生物法和HPLC方法相比成本低,消除了小鼠生物法的不可重復(fù)性及假陽性,以及避免了HPLC方法對一起設(shè)備的高要求,安全便捷,樣品只需簡單的提取便可用于檢測,從處理樣品到得到結(jié)果,檢測時間在30min之內(nèi),肉眼可判斷,不需要專業(yè)人員操作。由于膠體金試紙條檢測是定性半定量檢測方法,檢測結(jié)果的確定是由肉眼判斷檢線的有無及檢測線顏色的深淺,因此,在檢測過程中可能出現(xiàn)一些人為誤差,在肉眼觀測結(jié)果介于無色和淡紅色的樣本中,可能需要多組平行試驗。如需更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果,可結(jié)合ELISA及HPLC方法進行進一步的驗證。影響本試紙條的關(guān)鍵性因素為包被的單克隆抗體的特異性,與Stewart等建立的單克隆制備技術(shù)相比,本實驗室得到的基于單克隆抗體的免疫膠體金試紙條檢測技術(shù),靈敏度完全可以滿足O