腹瀉性貝毒的危害與防治

腹瀉性貝毒的危害與防治

近年來，隨著藥物紅色高峰的發(fā)生，這對中國的海洋生態(tài)和漁業(yè)造成了重大影響。赤潮毒素嚴重威脅了海洋養(yǎng)殖和人類健康。腹瀉性貝毒(DiarrheticShellfishPoisoning,DSP)是由有毒赤潮藻類鰭藻屬(Dinophysis)和原甲藻屬(Prorocentrum)產(chǎn)生的一類脂溶性多環(huán)醚類天然化合物,主要成分是軟海綿酸(OkadaicAcid,OA)及其衍生物,能引起食用者腹瀉、惡心等。腹瀉性貝毒能激發(fā)磷酸化來控制大腸細胞內(nèi)鈉的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A和PP2A的強烈抑制劑,也是一種很強的促癌劑,能引起消化道腫瘤的發(fā)生。我國海產(chǎn)品特別是貝類受腹瀉性貝毒沾污越來越嚴重。目前,腹瀉性貝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色譜法以及一些免疫化學方法。小鼠生物法簡便易行,適合于大規(guī)模、批量樣品的檢測,但不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu),干擾大、不精確。高效液相色譜法(HPLC),特別是液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù),可準確分析毒素的含量和種類,檢出限可低至ng/g,但樣品前處理繁瑣費時,且儀器昂貴。因此,建立快速、靈敏的赤潮毒素檢測方法,有利于開展大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)和生物樣品監(jiān)測計劃,對推動貝類毒素研究和保障人體健康十分重要。免疫化學方法是基于抗體對抗原的特異性結(jié)合的一種分析方法,具有靈敏度高,特異性強,儀器設備簡單,方法易掌握,樣品前處理相對簡單等優(yōu)點,適于現(xiàn)場監(jiān)測和大量樣本快速篩查,因而,近年在分析化學領域受到極大的重視且發(fā)展迅速?，F(xiàn)已有售德國、日本等公司生產(chǎn)的ELISA檢測DSP的試劑盒。國內(nèi)已有關(guān)于OA抗體制備和ELISA檢測方法的報道,有關(guān)腹瀉性貝毒膠體金檢測方法的研究也有報道。國內(nèi)尚未見應用免疫層析技術(shù)用于分析DSP的報道。本文用膠體金標記抗體,通過競爭免疫反應,研制快速檢測OA的免疫層析試紙條技術(shù),為我國腹瀉性貝毒監(jiān)測提供快速分析方法。1實驗部分1.1刀、玻璃器餅、試紙條模具BIODOT切割機,XYZ-3000噴點儀購自Biodot公司;JASCOV-550紫外/可見分光光度計;恒溫干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、試紙條模具均為國產(chǎn)。膠體金檢測用樣本墊(玻璃纖維素膜,10×300mm)、膠金墊(玻璃纖維素膜,8×300mm)、吸水紙(14×300mm)均購自Millipore公司;硝酸纖維素膜(NC膜,25×300mm)購自Sartorius公司。40nm膠體金,用1%檸檬酸三鈉水溶液燒制還原0.01%氯金酸水溶液,批量制備紫紅色的膠體金溶液,最大吸收波長538nm,其它試劑均為分析純。1.3抗體標記的確定1.3.1抗軟海綿酸單克隆抗體及包被抗原的制備本室自制OA-OVA偶聯(lián)抗原(4.65mg/mL)和抗OA-KLH單克隆抗體腹水,制備方法和性質(zhì)鑒定見參考文獻。1.3.2單克隆抗體腹水的純化用辛酸硫酸胺方法純化得到粗抗體,再用0.01mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)透析4～5d。用分光光度計測得抗體蛋白濃度為1.78mg/mL。1.3.3包被抗原濃度篩選OA-OVA偶聯(lián)抗原用PBS稀釋,稀釋倍數(shù)分別為原液、稀釋2倍、稀釋4倍,稀釋后點在NC膜上,37℃干燥1h備用?？乖瓏奛C膜:抗原用PBS稀釋4倍后用XYZ-3000噴點儀噴NC膜,噴量為:0.74μL/cm,Y=16cm,37℃干燥過夜,備用。1.3.4金標抗體的制備抗體標記量為20μg/mL。先取20mL40nm的膠體金于干凈的燒杯中,用1mmol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH值為8.2,加入抗體,使其在膠體金中濃度為20μg/mL,攪拌1h,加入膠體金1/10體積的10%牛血清白蛋白溶液,攪拌30min,5000r/min離心30min,取沉淀,用PBS復溶,約加入4mL緩沖液,用紫外分光光度計掃描膠體金特征吸收峰,確定膠體金OD值后用PBS緩沖液稀釋,使其OD值為5,分成100μL/管,插入點好各種抗原濃度的NC膜,觀察NC膜顯色情況,確定用稀釋4倍的抗原篩選抗體標記濃度。抗體標記量的選擇:按照金標抗體的制備方法,標記不同濃度的抗體量,分別為20、15、10、5μg/mL,配制適當濃度,使其OD值為5,用XYZ-3000噴點儀將金標抗體噴在膠金墊上,噴金量分別為10、8、6、4μL/cm,真空干燥2h,備用,抗體共計16個梯度條件。1.3.5貝類樣品處理方法貝類樣品的測定:取新鮮的扇貝,去殼,勻漿,取少許勻漿,加入OA標準品,使其含量為20μg/100g,取加標勻漿,用4倍體積(m∶V=1∶4)的80%甲醇-水超聲萃取5min,離心,上清液用PBS稀釋3倍,在96孔加樣板上,加80μL/孔,另加80μL/孔PBS為對照。2結(jié)果與討論2.1金標抗體條件和標準品溶液的選擇腹瀉性貝毒免疫層析快速檢測技術(shù)應用了競爭抑制免疫層析的原理,樣本中軟海綿酸OA在流動過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結(jié)合,抑制了抗體和NC膜檢測線上OA-OVA偶聯(lián)抗原的結(jié)合。如果樣本中OA含量大于12ng/mL,檢測線不顯顏色,結(jié)果為陽性;反之,檢測線顯紅色,結(jié)果為陰性。16個抗體條件的金墊,分別和稀釋4倍的NC膜組裝成試紙條,用PBS檢驗顯色程度。結(jié)果顯色均很深。降低抗體標記量,用稀釋4倍的NC膜檢測和調(diào)節(jié)抗體標記量,經(jīng)過細微摸索抗原濃度,最后確定用PBS稀釋8倍的檢測抗原制備NC膜,0.74μL/cm。降低標記量為5、4、3、2μg/mL,調(diào)制OD值為4、5、6,噴金量為2、2.5、3、3.5、4、6、8μL/cm,共84個金標抗體條件和稀釋8倍的包被抗原NC膜組裝,分別用空白(0.01mmol/LPBS)、PBS稀釋的軟海綿酸OA標準品20、15、12、10ng/mL檢測顯色程度和陽性抑制濃度。加樣量為80μL/孔,判斷時間為15min。最終選擇標記量為:2μg/mL,OD為5,噴3μL/cm,組裝雙金墊,NC膜為原液稀釋8倍的抗原條件組裝成試紙條,檢出限為12ng/mL。重復性實驗:按照上述實驗條件,重新標記抗體并噴抗原,組裝條件一致的試紙條,檢測結(jié)果和原條件實驗一致(圖1),空白液顯色一般(0號卡),陽性12ng/mL完全抑制無條帶出現(xiàn)(8號卡)。貝類DSP毒素提取需要80%的甲醇-水溶液,有機溶劑會干擾抗原抗體反應,因此在PBS緩沖液中添加不同濃度甲醇實驗,結(jié)果表明:檢測樣本中含30%以下甲醇對免疫學反應無影響。小鼠法陰性樣品驗證了此結(jié)果(圖2)。小鼠法陽性樣品有部分抑制,條帶顏色比空白淺(圖3)。對于加標貝樣萃取液的測定結(jié)果表明,15min內(nèi)空白對照顯紅色條帶,而貝樣的萃取液(含OA16.7ng/mL)無顏色條帶出現(xiàn)。當貝類勻漿用5倍體積的80%甲醇-水萃取時(含OA13.3ng/mL),實驗結(jié)果在15min內(nèi)無顏色條帶出現(xiàn),但放置長時間(大于2h)后,會出現(xiàn)極淺的條帶印跡。因此對于OA含量稍高于或接近于檢出限12ng/mL的樣品,一定要嚴格控制檢測時間,在15min內(nèi),與空白對照,得出結(jié)果,當時間過長,可能會由于極少量的金標抗體抗原復合物的長時間附著積累,以及其他一些非特異性吸附反應等的作用,而干擾試驗結(jié)果的判斷。2.2等價物測定一些國家規(guī)定的貝類組織中腹瀉性貝毒安全閾值是20μgOA等價物/100g貝肉,我國《有毒赤潮監(jiān)測嶄行規(guī)范》推薦20μgOA等價物/100g貝肉的限定值。應用研制的靈敏專一的抗軟海綿酸單克隆抗體,研究建立的貝類腹瀉性貝毒主要成份軟海綿酸的免疫快速檢測卡(檢出限12ng/mL,時間15min),不需要任何儀器設備,完全滿足該規(guī)定閾值,應用于貝類樣品中軟海綿酸的檢測。2.3聯(lián)免疫檢測方法免疫層析與酶聯(lián)免疫分析方法具有相似的原理,都是基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應而建立的免疫檢測技術(shù)。使用同一種抗體建立的酶聯(lián)免疫檢測方法比免疫層析檢測方法靈敏度高,但分析步驟多,反應時間長(2.5h),定量檢測需使用酶標儀完成;而免疫層析快速檢測方法雖然靈敏度低,但只使用一種試劑,一步操作,可在室溫長期保存,具有簡單、快速、準確、無污染、不需任何檢測儀器的優(yōu)點,特別適用于現(xiàn)場監(jiān)測篩選陽性樣品,然后使用色譜等儀器方法驗證鑒定。對于半定量的快速現(xiàn)場篩選具有其他方法不可比擬的優(yōu)點。2.4檢測方法的選擇本研究組曾制備抗OA-BSA單克隆抗體,由于特異性不高,最大抑制率只有30%,建立的免疫層析檢測方法靈敏度低,不具有可用于實際樣品檢測的使用價值;而本研究中使用的抗OA-KLH單克隆抗體,特異性高,最大抑制率可達到90%以上,因此使用其建立的免疫層析檢測方法靈敏度高,能夠滿足實際樣品安全規(guī)定值的檢測需要,建立的分析方法具有實用價值。結(jié)合率高的包被抗原。因為OA是小分子,不能直接吸附到硝酸纖維膜上,必需偶聯(lián)到大分子蛋白載體上。偶聯(lián)的分子比是影響檢測方法成功的關(guān)鍵因素之一。噴點在檢測線上的包被抗原OA-OVA,必需具有較高的OA結(jié)合比,才能夠使得競爭結(jié)合的金標記抗體的量能夠產(chǎn)生肉眼可識別的顏色變化,而達到檢測的目的。建立一種物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測方法的影響因素非常多。盡管在理論上已經(jīng)很成熟,可實際中成功率并不高,尤其對于小分子的間接競爭方法,困難更多。這是一個復雜的實驗過程,涉及到