酶工程課件：電泳

第四章酶的提取與分離純化預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。第三節(jié)電泳

電泳（electrophoresis,EP）：

指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程。電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一、電泳的基本理論

1.原理:

在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。

+-

遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)內(nèi)在特性：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀）外界條件：電場強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性

將帶凈電荷Q的粒子放入電場，受到的電引力為：

F引=EQ

在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV

當(dāng)F引=F阻時(shí)EQ=6πrηVEQV=6πrη

影響遷移率的因素：1）顆粒性質(zhì)：

Q越大、r越小、形狀越接近球形，v越快。2）電場強(qiáng)度：E越高，v越快。3）溶液性質(zhì)：

pH值：離pI越遠(yuǎn)，v越快。（用buffer保持恒定）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，v越低。原因：離子氛（ionicatmosphere）。通常，緩沖液離子強(qiáng)度在0.02-0.2之間。4）電滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動(dòng)。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。自由界面電泳：指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。區(qū)帶電泳:指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用:防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散。2.電泳的分類按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：②醋酸纖維素薄膜電泳：。以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。

③瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。

3.電泳常用設(shè)備

（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀（600V）

高壓電泳儀（3000V）

超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽：

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設(shè)備：

水平板式電泳槽垂直板式電泳槽二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。

1.原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1）化學(xué)催化系統(tǒng)：AP-TEMED

催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（TEMED）催化劑:核黃素（維生素B2）

引發(fā)劑:光

TEMED的存在，可加速聚合。.聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉雙丙烯酰胺聚合而成

凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）。

T=

C=

凝膠濃度越大（?。?，孔徑越小（大），可分離分子量較小（大）的顆粒。

Acr與Bis的重量比應(yīng)在30左右。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%樣品分子量（Da）適宜的凝膠濃度（％）蛋白質(zhì)<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表2.分離效應(yīng)

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)

連續(xù)PAGE1）電荷效應(yīng):

分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。2）分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3）濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。

2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。8.38.38.96.7聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品緩沖液pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

三、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡稱SDS－PAGE。是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量（relativemolecularmass,Mr）的一種最好的辦法。

SDSseparatesproteinsbyMW1.原理：

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。

兩者關(guān)系：蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。2.操作：（SDS及PAGE，即變性及非變性）1）制膠:

（變性：buffer中加0.4%SDS）

a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠（查表），配制分離膠溶液：

Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。

b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。2）樣品制備：

a.PAGE:樣品＋樣品緩沖液[蔗糖或甘油（增加比重）＋指示劑溴酚藍(lán)]b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍(lán)），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3）加樣及電泳：

SDS:電極buffer中加0.1%SDS，溴酚藍(lán)距下端1cm時(shí)停止電泳。4）固定及染色a.固定：將凝膠浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分。b.染色：

考馬斯亮藍(lán)染色法

銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍(lán)，過碘酸－Schiff試劑（糖蛋白）。理想顯色劑的7S

安全（safety）：

靈敏（sensitivity）：

簡單（simplicity）：

特異性（specificity）：

快速（speed）：

穩(wěn)定（stability）：

兼容性（synergy）：四、等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。1.原理

兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)不再泳動(dòng)，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。(2)導(dǎo)電性能好——以保持電場強(qiáng)度的均勻性。(3)分子量小——電泳后易分離除去。(4)化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測定。等電聚焦電泳2.操作：

1）凝膠配制：凝膠濃度T為5％~7.5％（C=3%

左右）

2）加樣：任意位置

3）電泳：