真菌生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)

真菌生物學(xué)檢驗(yàn)根本技術(shù)整理課件第一節(jié)概述真菌〔Fungus〕具有典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)〔細(xì)胞核、細(xì)胞器、細(xì)胞壁〕細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)和〔或〕纖維素?zé)o根、莖、葉，不含葉綠素以腐生或寄生方式攝取養(yǎng)料能進(jìn)行有性生殖和〔或〕無(wú)性繁殖整理課件對(duì)人類致病的真菌分為：

淺部真菌：侵犯皮膚、毛發(fā)、指甲，為慢性，頑固性，但影響身體較??；

深部真菌：可侵犯全身內(nèi)臟，嚴(yán)重的可引起死亡。此外，有些真菌寄生于糧食、飼料、食品中，能產(chǎn)生毒素引起中毒性真菌病。整理課件一、生物學(xué)性狀細(xì)胞壁為幾丁質(zhì)(Chitin)〔多聚N－乙酰葡萄糖組成〕，并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白質(zhì)，某些酵母菌還含類脂體。細(xì)胞內(nèi)有較為典型的核結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器?！惨弧承螒B(tài)結(jié)構(gòu)整理課件真菌多糖的分布真菌多糖主要分布于真菌的菌絲、子實(shí)體及其發(fā)酵液中。在不同的部位含量有所不同，在真菌的菌絲體的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中存在較多，其他地方較少。真菌多糖主要是在菌絲體細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中提取。整理課件真菌的形態(tài)①單細(xì)胞真菌呈圓形或橢圓形。以出芽方式繁殖。主要為酵母菌和類酵母菌，如隱球菌、念珠菌。②多細(xì)胞真菌由菌絲和孢子組成。菌絲分枝交織成團(tuán)，形成菌絲體〔Mycelium〕，并長(zhǎng)有各種孢子。通常稱之為絲狀菌或霉菌〔Mold〕。二相性真菌〔dimorphicfungus〕：孢子與菌絲可隨生存環(huán)境〔營(yíng)養(yǎng)、溫度、氧氣等〕的變化發(fā)生互變，如球孢子菌、組織胞漿菌及芽生菌。整理課件多細(xì)胞真菌的形態(tài)構(gòu)成菌絲營(yíng)養(yǎng)菌絲（伸入到培養(yǎng)基內(nèi)）氣生菌絲→生殖菌絲（露出于培養(yǎng)基表面）孢子有性孢子由同一菌體或不同菌體上的二個(gè)細(xì)胞融合形成絕大多數(shù)屬于非致病性真菌所具有無(wú)性孢子分生孢子分生孢子梗的頂端或側(cè)面大分生孢子小孢子菌屬、表皮癬菌屬小分生孢子毛癬菌屬葉狀孢子菌絲細(xì)胞直接形成芽生孢子隱球菌、念珠菌關(guān)節(jié)孢子球孢子菌、毛孢子屬厚膜孢子新型隱球菌子囊孢子菌絲末端形成膨大的囊狀結(jié)構(gòu)即孢子囊，內(nèi)含很多孢子根霉菌整理課件鹿角狀菌絲菌絲梳狀菌絲螺旋狀菌絲結(jié)節(jié)狀菌絲球拍狀菌絲整理課件大分生孢子小分生孢子孢子厚膜孢子芽生孢子孢子囊孢子整理課件整理課件大分生孢子整理課件整理課件分生孢子梗頂囊整理課件整理課件整理課件真菌孢子和細(xì)菌芽胞的區(qū)別真菌孢子細(xì)菌芽胞抵抗力不強(qiáng)。60-70℃短時(shí)間殺死強(qiáng)。煮沸短時(shí)間不死數(shù)目一條菌絲可產(chǎn)生多個(gè)孢子一個(gè)細(xì)菌體只形成一個(gè)芽孢作用為繁殖方式之一不是繁殖方式形成位置可在細(xì)胞內(nèi)外形成只在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成形狀形態(tài)、色澤多樣圓形或橢圓形整理課件〔二〕培養(yǎng)特性大多數(shù)真菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，常用沙保氏培養(yǎng)基〔SDA〕培養(yǎng)。淺部病原性真菌最適培養(yǎng)溫度為22-28℃，生長(zhǎng)緩慢，多于1-4周出現(xiàn)典型菌落。深部病原性真菌最適培養(yǎng)溫度為37℃，生長(zhǎng)較快，經(jīng)3-4天即長(zhǎng)出菌落。整理課件真菌菌落類型類型定義特征顏色舉例酵母型菌落為單細(xì)胞真菌的菌落，形態(tài)與一般細(xì)菌菌落相似，以出芽形式繁殖光滑、濕潤(rùn)，一般為乳白色新型隱珠菌類酵母型菌落外觀似酵母菌落，但可見(jiàn)伸入培養(yǎng)基中的假菌絲，由伸長(zhǎng)的芽生孢子形成光滑、濕潤(rùn)，一般為乳白色白色念珠菌絲狀菌落為多細(xì)胞真菌的菌落，由許多管狀、分枝菌絲體組成絨毛狀、絮狀、粉末狀、顆粒狀、石膏狀?？僧a(chǎn)生各種色素。毛癬菌整理課件整理課件整理課件整理課件〔三〕變異性真菌易發(fā)生變異，在人工培養(yǎng)基中屢次傳代或孵育過(guò)久，可出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌落性狀、色素及毒力等改變。整理課件〔四〕抵抗力真菌對(duì)枯燥、陽(yáng)光、紫外線及一般化學(xué)消毒劑有一定的耐受力，但充分暴露于陽(yáng)光，紫外線及枯燥情況下大多數(shù)真菌可被殺死，且對(duì)2.5%碘酒，10%福爾馬林都敏感，一般可用福爾馬林薰蒸被真菌感染的房間。對(duì)熱敏感，一般60℃1小時(shí)可殺死真菌菌絲和孢子。整理課件二、致病性與免疫性1.真菌性感染：主要是外源性感染淺部真菌侵犯皮膚、指甲及須發(fā)等組織，頑強(qiáng)繁殖，發(fā)生機(jī)械刺激損害，同時(shí)產(chǎn)生酶及酸等代謝產(chǎn)物，引起炎癥反響和細(xì)胞病變。深部真菌侵犯皮下，內(nèi)臟及腦膜等處，引起慢性肉芽腫及壞死?！惨弧持虏⌒哉碚n件2.條件致病性真菌感染：主要是內(nèi)源性感染〔如白色念珠菌〕，亦有外源性感染〔如曲霉菌〕。條件：慢性消耗性疾病。糖尿病、白血病、長(zhǎng)期應(yīng)用化療、皮質(zhì)類固醇激素的患者。免疫力低下，菌群失調(diào)。整理課件3．過(guò)敏性真菌?。河烧婢赃^(guò)敏原〔如孢子抗原〕引起過(guò)敏癥，如哮喘，變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎和癬菌疹等。4．真菌毒素中毒癥：侵犯害肝、腎、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及造血組織。如黃曲霉毒素、某些鐮刀菌素和黑葡萄穗素。整理課件〔二〕免疫性1．非特異性免疫：人類對(duì)真菌感染有天然免疫力。皮膚分泌短鏈脂肪酸和乳酸、血液中轉(zhuǎn)鐵蛋白、中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。2．特異性免疫：真菌感染中細(xì)胞免疫是機(jī)體排菌殺菌及復(fù)原的關(guān)鍵，T細(xì)胞分泌的淋巴因子、以T細(xì)胞為主導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反響引起免疫病理?yè)p傷能局限和消滅真菌，以終止感染。整理課件三、微生物學(xué)診斷常見(jiàn)標(biāo)本的類別①各種分泌物，包括泌尿生殖道分泌物、耳垢、痰及其他；②皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)如毛發(fā)、指〔趾〕甲、鱗屑及其他；③膿汁及滲出物；④血液及體液，體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等；⑤糞便和尿液；⑥活組織標(biāo)本；⑦環(huán)境中各種標(biāo)本材料?！惨弧?/p>

直接檢查整理課件1．不染色標(biāo)本的直接鏡檢：直接采取標(biāo)本制片、顯微鏡下直接觀察，假設(shè)發(fā)現(xiàn)真菌菌絲或孢子存在時(shí)，即可初步判定為真菌感染。1〕標(biāo)本制備：2〕檢查方法：3〕封固液：整理課件①KOH溶液：本液適于檢查致密的難以透明的材料〔如毛發(fā)、指甲、鱗屑等〕。②墨汁：主要用于檢查有莢膜的真菌〔如新型隱球菌等〕。③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力較強(qiáng)，只限于不透明的標(biāo)本。④生理鹽水：為觀察真菌的出芽現(xiàn)象可用生理鹽水代替氫氧化鉀溶液。整理課件本卷須知①采取部位要恰當(dāng)。深部真菌感染可采取膿汁、痰液、血液、腦脊液等。淺部真菌感染，應(yīng)刮取病變部位邊緣的痂、鱗屑。發(fā)癬應(yīng)取折斷的病發(fā)等。②標(biāo)本應(yīng)新鮮。特別是深部真菌標(biāo)本，盡量在取材后立即檢查，最長(zhǎng)不得超過(guò)兩小時(shí)，如不能立即送檢那么必須放入冰箱中保存，盡速送檢。整理課件③應(yīng)在用藥前采集標(biāo)本。如已用藥那么需停一段時(shí)間藥后再采集標(biāo)本。④標(biāo)本的采集量要充足。血液和腦脊液不得少于5ml，胸腔液不得少于20ml?；铙w組織要采取兩份，一份送病理科檢查，一份送鏡檢和培養(yǎng)。⑤防止污染雜菌。必須進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作，必要時(shí)在培養(yǎng)基內(nèi)參加抗生素類。整理課件整理課件整理課件2．染色標(biāo)本檢查：⑴革蘭氏染色：各種真菌均為革蘭氏陽(yáng)性，為深藍(lán)色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子絲菌、諾卡菌及組織胞漿菌等。⑵乳酸酚棉藍(lán)染色⑶糖原染色：菌體均染成紅色。用于標(biāo)本直接涂片及組織病理切片染色。⑷嗜銀染色〔GMS〕：染成黑色。整理課件⑸粘蛋白卡紅染色法〔MCS〕：主要用于新型隱球菌莢膜的染色。隱球菌莢膜和細(xì)胞壁呈紅色，細(xì)胞核呈黑色。⑹熒光染色：主要使用吖啶橙和氫氧化鉀來(lái)染直接涂片、培養(yǎng)涂片及組織切片。整理課件菌

種熒光反應(yīng)菌

種熒光反應(yīng)白色假絲酵母菌黃綠色曲菌綠色新生隱球菌紅色鼻孢子菌紅色組織胞漿菌紅黃色球孢子菌黃綠色皮炎芽生菌黃綠色常見(jiàn)深部真菌的熒光反響整理課件〔二〕培養(yǎng)檢查用于確定菌種，輔助直接檢查的缺乏；通常用沙保氏培養(yǎng)基(Sabouraud,含1％蛋白胨、4％葡萄糖或麥芽糖、2％瓊脂)〔SDA〕,22-28℃；深部真菌可用血瓊脂或腦心葡萄糖血瓊脂37℃培養(yǎng)。整理課件

小培養(yǎng)法：小培養(yǎng)法是采用真菌培養(yǎng)板或普通載玻片進(jìn)行真菌培養(yǎng)。培養(yǎng)物可直接于顯微鏡下檢查，也可經(jīng)染色后觀察。整理課件〔三〕免疫學(xué)試驗(yàn)用于檢測(cè)深部感染真菌的抗體，作為輔助診斷組織胞漿菌、念珠菌、曲霉菌。檢測(cè)深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特異的診斷。

乳膠凝集法檢測(cè)新型隱球菌病患者的莢膜多糖抗原

ELISA法檢測(cè)白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原免疫熒光法檢測(cè)孢子絲菌病患者的可溶性抗原整理課件四、防治原那么真菌感染尚無(wú)特異預(yù)防，主要注意公共衛(wèi)生和個(gè)人衛(wèi)生；碘化物治療孢子絲菌病、毛霉菌病有一定療效；制霉素、灰黃霉素、克霉唑〔三苯甲霉唑〕等外用或內(nèi)服對(duì)癬癥和白色念珠菌病等有較好療效；近年報(bào)道5-氟胞嘧啶〔5-FC〕治療單細(xì)胞真菌感染療效顯著；二性霉素B可用于深部全身真菌感染。整理課件第二節(jié)淺部真菌主要為絲狀菌，多侵犯皮膚、毛發(fā)、指甲等角化組織引起癬癥，又稱皮膚癬菌(Dermatophytes)。分為三屬，共37個(gè)種。整理課件一、生物學(xué)特征皮膚癬菌的特征屬名種數(shù)侵犯部位形態(tài)特征皮膚指甲毛發(fā)大分生孢子小分生孢子菌絲毛癬菌屬21+++細(xì)長(zhǎng)、棒形、壁薄，少見(jiàn)或無(wú)梨形、棒形，較多見(jiàn)螺旋狀、鹿角狀、結(jié)節(jié)狀、球拍狀、破梳狀，單純細(xì)菌絲小孢子癬菌屬15+-+紡錘形，壁較厚，較多見(jiàn)棒形，卵圓形，較少見(jiàn)球拍狀及破梳狀菌絲表皮癬菌屬1++－梨形、壁較薄，多見(jiàn)無(wú)單純菌絲整理課件角層癬菌枇糠狀鱗斑癬菌可引起汗斑整理課件整理課件皮膚癬菌含毛癬菌、表皮癬菌和小孢子癬菌三個(gè)屬，主要侵犯角化的表皮、毛發(fā)和指〔趾〕甲，引起皮膚癬病，包括手足癬、體癬、灰指甲、頭癬等。整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件二、檢驗(yàn)方法直接采取病變部位的標(biāo)本，用顯微鏡檢查有無(wú)菌絲及孢子的存在，本法迅速簡(jiǎn)便，是臨床真菌檢查最常用的方法?！惨弧持苯隅R檢整理課件整理課件皮下組織感染真菌包括著色真菌和申克孢子絲菌。著色真菌可引起著色真菌病、肢體橡皮腫等；申克孢子絲菌可引起孢子絲菌下疳,也可引起深部感染。整理課件整理課件取毛發(fā)、皮屑、甲屑等標(biāo)本，用70％乙醇消毒，接種沙保氏瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃，7-14天。根據(jù)菌落形態(tài)及顏色、并挑取菌落鏡檢菌絲及孢子的特征進(jìn)行鑒定?！捕硠e離培養(yǎng)整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件本法主要用于頭癬檢查。病發(fā)在濾過(guò)紫外燈照射下可發(fā)出不同色澤的熒光，如黃癬菌病發(fā)呈暗綠色熒光，白癬小孢子菌屬的病發(fā)呈亮綠色熒光等?！踩碂晒鈾z查整理課件第三節(jié)深部感染真菌深部真菌是侵犯皮下組織和內(nèi)臟，引起全身性感染的真菌。多數(shù)能引起慢性肉芽腫樣炎癥、潰瘍及壞死等病變整理課件①致病性真菌正常人體內(nèi)部不存在，一旦侵入機(jī)體，即可致病，如組織胞漿菌、球孢子菌、芽生菌等。屬外源性感染致病菌；②條件致病性真菌是人體正常菌群的成員，當(dāng)機(jī)體抵抗力和免疫力下降時(shí)可致病，如新型隱球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。深部感染真菌分類整理課件一、白色念珠菌白色念珠菌〔canidiaAlbicans〕又稱白色假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病。為條件致病性真菌。整理課件〔一〕生物學(xué)特性卵圓形，大小2μm×4μm，革蘭氏染色陽(yáng)性。有假菌絲。培養(yǎng)特性：典型類酵母型菌落，外表光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母氣味。涂片鏡檢，可看到表層為卵圓形芽生細(xì)胞，底層有較多假菌絲。整理課件整理課件整理課件整理課件〔二〕致病性和免疫性可侵犯人體多處部位，可引起：①皮膚念珠菌?。汉冒l(fā)于皮膚皺褶處；②粘膜念珠菌?。葫Z口瘡、口角炎、陰道炎最多見(jiàn)。③內(nèi)臟及中樞神經(jīng)念珠菌?。悍窝?、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎等。機(jī)體可產(chǎn)生一定免疫力。整理課件白假絲酵母菌在免疫力低下、菌群失調(diào)等情況下念珠菌可引起皮膚黏膜、內(nèi)臟、中樞神經(jīng)等各個(gè)部位的感染，稱為念珠菌病如鵝口瘡、呼吸道炎癥等。革蘭氏陽(yáng)性，圓形或卵圓形，以出芽方式繁殖；培養(yǎng)特性，普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，酵母型菌落。整理課件〔三〕檢驗(yàn)方法及鑒定1．直接鏡檢：革蘭氏染色鏡檢。2．培養(yǎng)特點(diǎn)：典型的酵母菌落。3．鑒定試驗(yàn)：①芽管試驗(yàn)；②TZC試驗(yàn)；③糖發(fā)酵和糖同化試驗(yàn)；④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；⑤厚膜孢子形成試驗(yàn)。4．血清學(xué)診斷：以念珠菌為抗原測(cè)定機(jī)體抗念珠菌抗體，用于診斷全身性念珠菌病。整理課件⑴芽管試驗(yàn)：取少許待檢的白色念珠菌接種于0.5ml人或兔血清中，混勻，直37℃水浴2-3h后，取出一接種環(huán)菌液，涂片、鏡檢。有芽管產(chǎn)生者為白色念珠菌，其他念珠菌不產(chǎn)生芽管。整理課件⑵TZC試驗(yàn)：將菌接種于含0.005％氯化三苯基四氮唑的沙保培養(yǎng)基中，經(jīng)22-25℃，24-48h培養(yǎng)。白色念珠菌不變色或僅為淡紅色，其他念珠菌或酵母菌呈紅色或深紅色。⑶糖發(fā)酵和糖同化試驗(yàn)：根據(jù)這兩種試驗(yàn)可將常見(jiàn)的幾種念珠菌進(jìn)行鑒別。糖同化試驗(yàn)：①將1%的各類糖浸入直徑6-10mm的4號(hào)新華濾紙片。②將紙片枯燥后放-20℃?zhèn)溆?。③制備無(wú)營(yíng)養(yǎng)成份的固體瓊脂平板〔9-12cm〕。④將0.5濁度待檢菌均勻涂布于以上平板上，貼上不同的以上含糖紙片。35℃，24-48h。⑤假設(shè)某糖紙片四周有明顯的細(xì)菌生長(zhǎng)，那么為此糖同化試驗(yàn)陽(yáng)性。整理課件⑷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：本菌對(duì)兔有致病力。兔耳靜脈注射本菌，經(jīng)4-5天死亡。解剖可見(jiàn)腎、肝腫脹、充血，并有小膿腫，涂片及培養(yǎng)均可見(jiàn)本菌及其假菌絲存在。⑸厚膜孢子形成試驗(yàn)：本試驗(yàn)亦是鑒定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯－80瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)本菌，鏡檢觀察到厚膜孢子及假菌絲。整理課件整理課件整理課件二、新型隱球菌又名溶組織酵母菌，是土壤，鴿類，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中?？汕址溉撕蛣?dòng)物，一般為外源性感染，但也可能為內(nèi)源性感染，對(duì)人類而言，它通常是條件致病菌。整理課件〔一〕生物學(xué)特性較大球形，直徑可達(dá)5-20um，有肥厚的莢膜，折光性強(qiáng)，一般染料不易著色，難以發(fā)現(xiàn)，稱隱球菌，用墨汁陰性顯影法鏡檢，可見(jiàn)到透明莢膜包裹著菌細(xì)胞，菌細(xì)胞常有出芽，但不生成假菌絲。整理課件整理課件整理課件在沙保氏瓊脂及血瓊脂培養(yǎng)基上，于25及37℃皆可生長(zhǎng)，而非病原性隱球菌在37℃不能繁殖。酵母型菌落，呈白色。本菌能分解尿素，以此與酵母菌和念珠菌鑒別。整理課件整理課件〔二〕致病性本菌多由呼吸道轉(zhuǎn)入，在肺部引起輕度炎癥，或隱性傳染。可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)生腦膜炎、腦炎、腦肉芽腫等。還可侵入骨骼、肌肉、淋巴結(jié)、皮膚粘膜引起慢性炎癥和膿腫。整理課件整理課件新生隱球菌大量存在于枯燥的鴿糞中，通過(guò)呼吸道感