應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和雙鏈異源泳動(dòng)分析技術(shù)對(duì)血友病甲遺傳咨詢的比較研究

應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和雙鏈異源泳動(dòng)分析技術(shù)對(duì)血友病甲遺傳咨詢的比較研究

血液中的友病性疾病是由人類由于凝血因子基因缺陷引起的x射線衍射障礙引起的隱形疾病。20世紀(jì)80年代以來(lái)利用因子Ⅷ基因內(nèi)和基因旁限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性(RFLP)進(jìn)行連鎖分析是國(guó)內(nèi)外血友病甲基因診斷和產(chǎn)前基因診斷的重要技術(shù)方法。但由于突變類型的不同RFLP連鎖分析的使用有一定的局限性。隨著聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在基因診斷中的廣泛應(yīng)用,長(zhǎng)距離擴(kuò)增凝血Ⅷ因子基因?qū)χ匦脱巡〖椎幕蛟\斷獲得重大突破。但對(duì)于其他突變類型的血友病甲基因診斷仍需進(jìn)一步的探索。20世紀(jì)90年代,發(fā)現(xiàn)人的FⅧ基因13號(hào)內(nèi)含子高可變二核苷酸重復(fù)序列在不同人群中的多態(tài)性,并且已經(jīng)引入到血友病甲的基因診斷研究中,為探索一種更簡(jiǎn)便,更特異的血友病甲的基因診斷方法。我們對(duì)10例血友病患兒及其家系中成員,男性20例,女性10例,共40條X染色體的凝血Ⅷ因子內(nèi)二核苷酸重復(fù)序列的多態(tài)性進(jìn)行了研究,報(bào)告如下。對(duì)象和方法一、sds的制備本組共10例血友病甲患兒(男)(均經(jīng)人民醫(yī)院臨床血液學(xué)檢驗(yàn)診斷為血友病甲),家系成員20例(男10例,女10例)及無(wú)關(guān)成年女性2例取外周抗凝血2ml,三蒸水低滲破碎紅細(xì)胞,2000r/min,10min離心收集白細(xì)胞,PBS反復(fù)洗兩次,加0.5ml細(xì)胞裂解液(15mmol/LTris-HCL,pH8.0,0.15mmol/LEDTA,15mmol/LNaCl),1/10體積的10%SDS,50μg/ml蛋白酶K混勻,37℃過(guò)夜,次日,酚-氯仿法抽提,無(wú)水乙醇沉淀DNA,室溫干燥,溶于50μl無(wú)菌三蒸水中,4℃貯存?zhèn)溆?。二、taq酶pcr擴(kuò)增PCR試劑盒購(gòu)自華美生物技術(shù)公司。TakaRa生物技術(shù)公司合成引物,序列如下:A1:5′-TGCATCACTGTACATATGTATCTT-3′A2:5′-CCAAATTACATATGAATAAGCC-3′PCR反應(yīng)50μl反應(yīng)體系含1μgDNA模板,引物A1,A2各10pmol/L,2.5單位Taq酶,10mmol/LdNTP,反應(yīng)條件為95℃變性5min,94℃45s,55℃45s,72℃60s,30個(gè)循環(huán)。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。三、rss-lnacl-tis-hcl的聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳取10μl患者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,10μl同一家系母親PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,2.2μl10×異源雙鏈雜交液(1mol/LNaCl,100mmol/LTris-HCl,pH7.8,20mmol/LEDTA,pH8.0)混勻,沸水煮5min,快速放入冰浴中,放置20min,分別加入上樣Buffer4μl,在8%的聚丙烯酰胺凝膠上,1×TBE電泳Buffer,250V電壓電泳3h,電泳完畢,于0.5μg/ml溴化乙啶中染色1h,紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果一、凝血f因子13內(nèi)含子的can二核苷酸重復(fù)序列及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定10例血友病甲患兒及其家系中成員30個(gè)DNA樣品和2例無(wú)關(guān)女性的DNA樣品,PCR擴(kuò)增凝血FⅧ因子13內(nèi)含子的(CA)n二核苷酸重復(fù)序列,其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,所有樣品均可見(jiàn)長(zhǎng)約140～150bp多DNA片段(圖1)。男性呈現(xiàn)單一的DNA條帶,女性則根據(jù)不同的等位基因可出現(xiàn)兩條或者一條DNA條帶。二、10家系中can的獲得和賠償根據(jù)圖1電泳顯示凝血Ⅷ因子基因中13內(nèi)含子重復(fù)序列長(zhǎng)度的多態(tài)性,對(duì)10例血友病甲家系進(jìn)行等位基因連鎖分析。10個(gè)家系中(CA)n的拷貝數(shù)均為20～23。10例患兒的(CA)n拷貝數(shù)均與母親兩條X染色體中一條(CA)n的拷貝數(shù)一致,即母親為攜帶者。10例患兒中8個(gè)為雜合子,2個(gè)為純合子,經(jīng)過(guò)(CA)n多態(tài)性的連鎖分析,可以鑒別出Ⅷ因子異?；虻臄y帶者。三、同源雙鏈的dna電泳血友病患者的重復(fù)序列擴(kuò)增片段與家系中隱性攜帶者的擴(kuò)增片段經(jīng)異源雙鏈雜交,于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,形成異源雙鏈的DNA條帶,或同源雙鏈的DNA條帶,同源雙鏈的泳動(dòng)速度快于異源雙鏈。同源雙鏈泳動(dòng)在前,異源雙鏈泳動(dòng)在后(圖3)。電泳結(jié)果顯示了雙鏈dna的重復(fù)序列,特點(diǎn)就是表現(xiàn)在體我們對(duì)10例血友病甲患兒及其家系,其中包括10個(gè)女性,20個(gè)男性,共40條X染色體DNA樣品,分別擴(kuò)增了凝血因子Ⅷ基因13內(nèi)含子(CA)n的重復(fù)序列,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,男性樣品均呈現(xiàn)出單一的DNA條帶,女性可呈現(xiàn)一條或兩條DNA條帶。如果來(lái)自母親的一條X染色體和來(lái)自父親的一條X染色的(CA)n重復(fù)數(shù)目相同時(shí),電泳在同一位置上,則顯示出一條帶。這種情況在10例女性DNA樣品中,有2例。如果兩條X染色體(CA)n的重復(fù)數(shù)目不同時(shí),電泳則出現(xiàn)兩條帶。本研究結(jié)果證明了二核苷酸重復(fù)序列廣泛存在于血友病甲的患兒及其家系的基因組中,其重復(fù)數(shù)目在20到23之間,結(jié)果與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)曾報(bào)道的一致。異源雙鏈泳動(dòng)分析中,血友病患者的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與母親的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性、退火、異源雜交,8%聚丙烯酰胺凝膠中140～150bp處都可見(jiàn)到一條同源的雙鏈DNA雜交帶,結(jié)合血友病甲家系等位基因連鎖分析可明確鑒別出血友病甲家系中有病基因的攜帶者。此法用于鑒別血友病甲的有病基因的攜帶者或產(chǎn)前遺傳病咨詢,與傳統(tǒng)使用的RFLP連鎖分析相比,具有準(zhǔn)確,簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。由于二核苷酸重復(fù)序列穩(wěn)定地存在于人類基因組中,作為第二代的遺傳標(biāo)志,可用于遺傳病的基因分析。在我們分析的群體中,13內(nèi)含子