先天性甲狀腺功能減退癥患者shr基因突變與家系遺傳分析

先天性甲狀腺功能減退癥患者shr基因突變與家系遺傳分析

天津醫(yī)科大學(xué)新生兒驗證室自1982年開展新生兒先天性甲狀腺功能減退（a級）。在評估兒童時，他們立即補充了甲狀腺激素，并根據(jù)醫(yī)療建議接受治療。長期療效滿意。先天性甲減發(fā)病與某些基因的突變有關(guān),然而大部分病例的發(fā)病機制尚不清楚。TSH受體(TSHR)等位基因的失活性突變,表現(xiàn)為甲狀腺對TSH完全或部分不敏感,TSH-TSHR-cAMP級聯(lián)反應(yīng)功能障礙,導(dǎo)致甲狀腺發(fā)育不良和(或)激素合成障礙。TSHR基因突變引起先天性甲減的家系報道越來越多,大部分突變位于TSHR基因第10號外顯子編碼區(qū),其次是第1、4、6號外顯子。TSHR突變位點不同,臨床表現(xiàn)不盡一致,突變基因型與臨床表型存在異質(zhì)性。為了探討天津市區(qū)先天性甲減TSHR基因突變情況及遺傳規(guī)律,本研究采用PCR-SSCP及DNA測序方法研究18例先天性甲減患者TSHR第1、4、6、10號外顯子基因突變情況。對象和方法一、病例選擇選擇結(jié)果天津醫(yī)科大學(xué)新生兒篩查室檢出并經(jīng)實驗室檢測確診的先天性甲減患者18例(男11,女7),年齡(11.9±7.4)歲(2個月～22歲)。除一個家系兄妹同患此病外,均為散發(fā)。所有患者經(jīng)B超、99mTc掃描檢查,甲狀腺缺如10例,異位1例,發(fā)育不良4例,甲狀腺腫大3例。TSH受體抗體(TRAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)及甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)均為陰性,無其他先天性畸形,父母及其他家庭成員無臨床甲減表現(xiàn)。隨機選擇健康體檢者35名為正常對照組(男18,女17),年齡(26.1±10.6)歲(6～44歲)。無甲狀腺疾病家族史,甲狀腺激素檢測無異常、自身抗體TRAb、TPOAb及TGAb均陰性。二、方法1.提取dns用TKM法提取外周血白細胞基因組DNA。2.增加tshpa,2.2擴增全序列參考有關(guān)文獻合成引物,PCR分別擴增TSHR基因第1、4、6、10號外顯子,記做TSHR-exon1(302bp,60℃)、TSHR-exon4(329bp,58℃)、TSHR-exon6(293bp,52℃),第10號外顯子分5段擴增全序列,分別為TSHR-A(357bp,58℃)、TSHR-B(376bp,58℃)、TSHR-C(356bp,60℃)TSHR-D(323bp,58℃)、TSHR-E(310bp,60℃)。引物由北京奧科生物公司合成。3.循環(huán)次數(shù):以5s,32s,3230s,94℃預(yù)變性2min,94℃30s,58℃～60℃30s,72℃30s,共循環(huán)30次,循環(huán)完成后72℃延伸5min。用含溴化乙錠的2%瓊脂糖電泳觀察PCR產(chǎn)物擴增情況,如在相應(yīng)分子量位置擴增帶清晰,可進行下一步的SSCP分析。4.電泳總pcr檢測應(yīng)用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠4℃～8℃150V,電泳14～16h后硝酸銀染色。每次電泳都以正常對照組作為參照,若同時電泳的患者PCR產(chǎn)物出現(xiàn)條帶增多、減少或條帶泳動增快、減慢即說明存在變異。每份標(biāo)本均做2次SSCP。5.dna序列分析對電泳出現(xiàn)異常條帶的患者PCR產(chǎn)物測序,采用BeckmanCoulter公司CEQ8000型DNA序列分析儀進行正反雙向測定。測序引物同PCR引物,計算機軟件自動處理數(shù)據(jù),以波形和堿基序列輸出測序結(jié)果。結(jié)果一、sscp的觀察TSHR基因第1、4、6、10號外顯子PCR產(chǎn)物,用含溴化乙錠的2%瓊脂糖電泳觀察,條帶清晰可用于SSCP。全部先天性甲減患者TSHR第1、4、6、10號外顯子PCR-SSCP分析后,在同1例先天性甲減患兒發(fā)現(xiàn)TSHR-BSSCP電泳條帶明顯減慢,TSHR-ESSCP電泳條帶明顯增快,重復(fù)2次結(jié)果均相同(圖1)。二、tshr突變1.臟器正常運行及組織學(xué)檢查對1例先天性甲減患兒TSHR-B、E正反向測序發(fā)現(xiàn)2處點突變,均為純合子型:1349G→A,密碼子由CGC轉(zhuǎn)換為CAC,450位氨基酸置換即Arg450→His;2181C→G,密碼子由GAC轉(zhuǎn)換為GAG,727位氨基酸置換即Asp727→Glu(圖2、3)。先證者男性,出生后用時間分辨熒光免疫分析濾紙干血TSH及T4紙片RIA試劑盒篩查,結(jié)果分別為TSH46.7mIU/L,T415.48nmol/L,甲狀腺B超示雙側(cè)甲狀腺形態(tài)發(fā)育欠佳,甲狀腺ECT檢查示顯像稀疏,核素攝取低下,甲狀腺發(fā)育不良,TGAb、TPOAb均陰性。診斷為先天性甲減,甲狀腺發(fā)育不良。即開始服甲狀腺片10mg/d,逐漸調(diào)整劑量。2～3月齡父母曾自行停藥,發(fā)現(xiàn)皮膚粗糙后就診,口服左旋甲狀腺素(L-T4)片至今,智力骨骼發(fā)育正常。2.復(fù)合雜合子遺傳圖譜對10名家系成員TSHR-B、E正反向測序,篩查出R450H/D727E復(fù)合雜合子6人:Ⅰ2、Ⅰ4、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ7、Ⅱ8,以女性攜帶為主,隱性遺傳規(guī)律,繪制系譜圖(圖4～6)。家系成員10人血清甲狀腺激素均正常,雜合子中5人血清sTSH輕微增高(表1)。tsh基因突變TSH與TSHR結(jié)合后與G蛋白的α亞單位(Gsα)偶聯(lián)并激活cAMP信號系統(tǒng)發(fā)揮作用,從而調(diào)控甲狀腺細胞分化、分泌功能。依賴TSH的cAMP級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的功能過強或過弱都將影響甲狀腺細胞增殖與功能。TSHR基因失活性突變導(dǎo)致先天性甲減,為常染色體隱性遺傳,多數(shù)家系表現(xiàn)為2個位點復(fù)合雜合子,亦有1個位點純合子。第10號外顯子編碼TSHR肽鏈穿膜區(qū),失活性突變與基因多態(tài)性大部分位于第10號外顯子。TSHR基因450位密碼子由CGC轉(zhuǎn)換為CAC,結(jié)果450位氨基酸置換即Arg450→His(R450H),R450H型突變位于TSHR第2穿膜段,首先由Nagashima等報道,篩查TSH抵抗的1對兄弟的TSHR基因,2人突變位點一樣,均為R450H和G498S雙位點雜合子型突變,血清TSH增高,甲狀腺激素正常,甲狀腺解剖位置正常,僅有輕度發(fā)育不良。其父母為1個位點突變雜合子,均不發(fā)病,TSH未增高。將R450H和G498S型突變基因分別轉(zhuǎn)染COS-7細胞,攜帶R450H型基因細胞對TSH反應(yīng)降低,cAMP水平輕度下降,而轉(zhuǎn)染G498S型基因細胞對TSH反應(yīng)明顯降低,cAMP水平低于前者。流式細胞儀分析二者在細胞膜表達均較野生型低,轉(zhuǎn)染G498S型基因的細胞更為顯著。本研究發(fā)現(xiàn)的TSHR基因突變型、臨床表現(xiàn)均與Nagashima等報道不同,該患兒復(fù)合純合子R450H/D727E,血清甲狀腺激素降低,診斷為先天性甲減。R450H純合子型突變導(dǎo)致該患兒發(fā)病,這表明R450H純合子比雜合子對甲狀腺發(fā)育與功能影響更顯著。R450H純合子失活性突變導(dǎo)致TSHR肽鏈一級結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域改變,TSH與TSHR結(jié)合后與Gsα偶聯(lián)障礙,不能正常激活cAMP信號系統(tǒng),TSH對甲狀腺上皮細胞的功能調(diào)節(jié)作用缺陷,依賴TSH的cAMP調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的功能減弱,從而影響甲狀腺細胞增殖及功能,結(jié)果表現(xiàn)為甲狀腺發(fā)育差,功能減退。該患兒為甲狀腺發(fā)育不良的永久性甲狀腺功能減退癥,適合甲狀腺激素終生替代治療。另有研究證明,甲狀腺功能正常高TSH血癥并且非自身免疫性亞臨床甲減可能存在TSHR基因突變。Alberti等研究10例非自身免疫性亞臨床甲減,sTSH輕到中度升高,4例存在TSHR基因突變;deRoux等研究1家族中3例甲狀腺功能正常的高TSH血癥患者,發(fā)現(xiàn)TSHR基因為混合性雜合子突變Ile167Asp/Pro162Ala。本研究與這些報道有相似之處。本組Ⅰ2、Ⅰ4、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ7、Ⅱ8共計6人同時存在R450H/D727E復(fù)合雜合子型點突變,以女性攜帶為主,為隱性遺傳。6例雜合子中除Ⅱ7外5例sTSH輕微升高,這種復(fù)合雜合子可能存在一定程度TSH抵抗,但甲狀腺功能仍然保持正常,并無臨床甲減表現(xiàn)。亞臨床甲減診斷主要依據(jù)血清TSH值,其正常范圍尚需統(tǒng)一。國內(nèi)報道測定2247名正常人TSH,確定TSHICMA法正常值:3.0～4mIU/L,在診斷亞臨床甲減采用血清TSH>4.8mIU/L標(biāo)準。對亞臨床甲減的篩查與治療頗有爭議,若血清TSH>10mIU/L且TPOAb陽性或高膽固醇血癥可以給予L-T4治療。Surks等總結(jié)1995～2002年195篇關(guān)于亞臨床甲減的文獻,認為亞臨床甲減與臨床甲減肯定關(guān)聯(lián),血清TSH>10mIU/L與高膽固醇血癥肯定關(guān)聯(lián),但給予甲狀腺激素干預(yù)后的效果證據(jù)不足。本研究中5例R450H/D727E雜合子的sTSH輕微升高,這種已經(jīng)明確基因突變的亞臨床甲減病例不多見,對于6.0mIU/L<sTSH<10mIU/L的雜合子,臨床工作中如何提高診治水平是個具有挑戰(zhàn)性課題。D727E位于TSHR胞內(nèi)C端,目前認為它是TSHR基因的多態(tài)性,D727E在功能自主性甲狀腺病中有一定分布頻率,