酵母-葡聚糖和桿菌肽鋅對(duì)早期斷奶犢牛生長(zhǎng)性能及胃腸道發(fā)育的影響

酵母-葡聚糖和桿菌肽鋅對(duì)早期斷奶犢牛生長(zhǎng)性能及胃腸道發(fā)育的影響

胃不僅是動(dòng)物消化和吸收食物的主要場(chǎng)所，也是身體的第一個(gè)防御屏障。定植于動(dòng)物胃腸道中的良好的微生物菌群對(duì)腸道的組織形態(tài)、代謝和功能有極大的影響,有助于更大程度地發(fā)揮動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。新生犢牛由于胃腸道消化機(jī)能及免疫屏障功能發(fā)育不健全,極易受病原微生物的侵害而引起腹瀉,導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率。飼用抗生素(antibiotics)通過非選擇性抑菌或殺菌作用,可消除腸道有害微生物對(duì)犢牛生長(zhǎng)的抑制作用。但是近年來,鑒于抗生素的大量使用導(dǎo)致了腸道菌群失衡等負(fù)效應(yīng),各國(guó)對(duì)抗生素的使用管理也越來越嚴(yán)格。因此,益生素(probiotics)的研究和應(yīng)用逐步成為研究熱點(diǎn)之一。研究表明,在5周齡內(nèi)犢牛的代乳粉中添加抗生素和益生素對(duì)于降低犢牛腹瀉和提高生長(zhǎng)性能具有相似的效果。研究進(jìn)一步證實(shí),益生素可抑制由溶血性大腸桿菌導(dǎo)致的幼齡反芻動(dòng)物腹瀉,進(jìn)而促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。酵母β-葡聚糖不同于植物細(xì)胞壁中的β-(1→4)葡聚糖,酵母β-葡聚糖主要來源于酵母細(xì)胞壁,是由D-葡聚糖通過β-(1→3)鍵的方式相結(jié)合,并含有高度分支的β-(1→6)鍵結(jié)合的多聚糖。它在消化道中不可溶,不吸收,同時(shí)不產(chǎn)生黏性。目前,關(guān)于酵母β-葡聚糖在幼齡反芻動(dòng)物中應(yīng)用的研究報(bào)道較少,特別是關(guān)于它對(duì)犢牛腸道微生物區(qū)系影響的報(bào)道就更為少見。本試驗(yàn)擬從早期斷奶犢牛生長(zhǎng)性能、腸道主要微生物數(shù)量及胃腸道組織發(fā)育3方面來比較酵母β-葡聚糖與抗生素對(duì)早期斷奶犢牛腸道發(fā)育的影響,以期為早期斷奶犢牛胃腸道發(fā)育調(diào)控提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1桿菌肽鋅的合成酵母β-葡聚糖為淡黃色粉末,購(gòu)自珠海天添生物工程技術(shù)有限公司(批號(hào)20080701),干物質(zhì)含量95.58%,粗蛋白質(zhì)含量4.57%,純度為82.75%。桿菌肽鋅為淡褐色粉末,購(gòu)自天津新星獸藥廠,含量15%。大腸桿菌購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,菌株號(hào)cvcc222,血清型O141∶K99,是引起犢牛腹瀉的主要治病菌。1.2試驗(yàn)內(nèi)容和方案試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地進(jìn)行。選取20頭新生健康荷斯坦公犢牛(購(gòu)自三元奶牛場(chǎng)),按體重和出生時(shí)間一致原則隨機(jī)分成4組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1頭牛。犢牛1~7日齡飼喂鮮乳,飼喂量為犢牛體重的8%。飼養(yǎng)試驗(yàn)于犢牛1周齡時(shí)進(jìn)行,全期共28d。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧包括犢牛代乳粉和開食料2部分。整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)每天分別于08:00和18:00飼喂?fàn)倥４榉埏暭Z(用煮沸后冷卻至40~45℃的熱水與代乳粉干物質(zhì)按7∶1的重量比沖泡),乳液飼喂量為犢牛體重的10%。于犢牛第21日齡起開始訓(xùn)練犢牛采食開食料飼糧,各組犢牛開食料的飼喂采用限飼制度,每頭犢牛每天補(bǔ)飼300g,自由飲水,記錄每天采食量。每頭犢牛單獨(dú)飼養(yǎng)于0.9m×3.5m的犢牛圍欄,下鋪設(shè)漏縫地板。試驗(yàn)用代乳粉為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所家畜營(yíng)養(yǎng)與飼料研究室研發(fā)的產(chǎn)品,開食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平與代乳粉營(yíng)養(yǎng)水平見表1和表2。每千克開食料含Onekgofstarterdietcontains:Fe9mg,Cu12.5mg,Mn130mg,Zn100mg,Se0.3mg,I1.5mg,Co0.5mg,VA15000IU,VD35000IU,VE50mg。1.3驗(yàn)組的材料試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),A組為對(duì)照組,B、C、D組為試驗(yàn)組,具體見表3。在試驗(yàn)第21天晨飼時(shí),通過將大腸桿菌肉湯培養(yǎng)基(109個(gè)/mL)混入犢牛代乳品中對(duì)A、B、D3組進(jìn)行口服大腸桿菌攻毒,攻毒劑量約為30mL。1.4樣品采集、測(cè)量設(shè)計(jì)和方法1.4.1體重和耗料量在試驗(yàn)開始第1、14、21、28天晨飼前,稱取每頭犢牛的空腹體重。每日記錄犢牛代乳粉和開食料的耗料量。統(tǒng)計(jì)各階段犢牛的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和飼料轉(zhuǎn)化率(F/G)。1.4.2腸道內(nèi)容物的制備于試驗(yàn)第21天分別采集攻毒后3、12、24h犢牛直腸內(nèi)約10cm處靠近上壺腹黏膜部的糞便樣品,無菌操作,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,放入帶有玻璃珠的三角瓶中,稱重后以1∶9(W/W)的比例加入無菌生理鹽水,依次以10倍梯度稀釋,選擇適宜的稀釋度,分別涂布在乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(MRS)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司),每個(gè)梯度做3組重復(fù),于37℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)72、24h后計(jì)算菌落數(shù),并以用1g腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)[lg(cfu/g)]表示直腸內(nèi)容物中主要微生物數(shù)量。1.4.3組織切片及形態(tài)測(cè)量試驗(yàn)第28天晨飼前從各組隨機(jī)選取3頭犢牛,用4%戊巴比妥鈉溶液(40mg/kgBW)將犢牛完全麻醉后,剖開腹腔分別在前背盲囊部分用利剪連續(xù)取下1cm2的組織塊,另取十二指腸近端5cm處、空腸中段和回腸中段約1cm的腸管,用生理鹽水沖洗殘余內(nèi)容物后,迅速將樣品浸泡至入4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)中固定,4℃固定48h后,石蠟包埋做組織切片。瘤胃及腸道固定樣品經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后,在10×10倍光鏡(MoticBA200)下觀測(cè)其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,并利用Moticimagesadvanced3.2軟件測(cè)量瘤胃前背盲囊乳頭高度、乳頭寬度及黏膜厚度,小腸各部位絨毛高度、隱窩深度及黏膜厚度。每個(gè)樣本觀察2個(gè)非連續(xù)切片,每張切片選取3個(gè)視野,每個(gè)視野分別測(cè)定10組數(shù)據(jù),其平均值作為1個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)。1.5平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析利用SAS8.2軟件包中的平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過程(ANOVA)進(jìn)行,均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。2結(jié)果2.1對(duì)adg和f/g的影響由表4可見,大腸桿菌攻毒前,即第1~14天和第14~21天2個(gè)階段時(shí),與對(duì)照組相比,B組犢牛ADG分別提高了26.17%和24.93%(P<0.05),D組犢牛ADG分別提高了30.89%和28.57%(P<0.05);大腸桿菌攻毒后,即第22~28天期間,B、D組ADG分別比對(duì)照組提高了30.38%和30.81%(P<0.05),但與C組差異不顯著(P>0.05)。對(duì)于試驗(yàn)各期F/G,B、D組均顯著低于對(duì)照組,特別是大腸桿菌攻毒后,B、D組F/G比對(duì)照組分別降低了15.74%和20.81%(P<0.05),與C組差異不顯著(P>0.05)。同樣的,從試驗(yàn)全期來看,B、D組F/G比對(duì)照組分別降低了17.53%和19.58%(P<0.05)。2.2各組大鼠攻毒后乳酸官情況比較由表5可見,大腸桿菌攻毒后3、12和24h,B組犢牛直腸中乳酸桿菌數(shù)量高于對(duì)照組,但是差異不顯著(P>0.05),D組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)乳酸桿菌數(shù)量均顯著低于B、C和對(duì)照組(P<0.05);而B、C組之間犢牛直腸乳酸桿菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。C組犢牛直腸中乳酸桿菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比,大腸桿菌攻毒后12h,B、D組顯著降低了犢牛大腸桿菌攻毒后12和24h時(shí)直腸中大腸桿菌數(shù)量(P<0.05),分別降低了9.79%、10.09%與16.35%、15.38%。同時(shí),B組在12和24h時(shí)犢牛直腸大腸桿菌數(shù)量顯著高于C組(P<0.05)。同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母者差異顯著(P<0.05),下表同。Inthesamerow,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05),thesameasbelow.2.3各組大鼠陰血壓v/c組,c組與b組含量比較由表6可見,與對(duì)照組相比,B、C組可顯著增加犢牛瘤胃乳頭高度、寬度(P<0.05)。與對(duì)照組相比,各組犢牛十二指腸絨毛高度無顯著差異(P>0.05),而C、D組犢牛十二指腸隱窩深度顯著低于對(duì)照組和B組(P<0.05);B、C和D組絨毛高度和隱窩深度比(V/C)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組犢?？漳c中段絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P>0.05),絨毛高度和隱窩深度比(V/C)也以試驗(yàn)B、C組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)?；啬c中段各形態(tài)指標(biāo)與空腸中段變化趨勢(shì)相同,各組間絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P>0.05),但B、C和D組V/C顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。3討論3.1-葡聚糖對(duì)幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響桿菌肽鋅是多肽類抗生素,一方面它可以抑制腸內(nèi)病原性微生物的增殖,促進(jìn)有益微生物的生長(zhǎng),減少發(fā)病率,從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng);另一方面,桿菌肽鋅可使畜禽腸壁變薄,增加腸黏膜的通透性和改變腸內(nèi)代謝環(huán)境,從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收。研究表明,在火雞飼糧中添加桿菌肽鋅20、50和100mg/kg,飼料轉(zhuǎn)化率分別提高了0.4%、1.1%和1.5%,增重分別提高了1.6%、2.3%和2.8%。據(jù)報(bào)道,在仔豬飼料中添加桿菌肽鋅50mg/kg,增重比添加土霉素組提高了22.4%,飼料轉(zhuǎn)化率提高了14.5%,并證明桿菌肽鋅與硫酸抗敵素合用,可明顯提高仔豬的增重、飼料報(bào)酬及具有良好的預(yù)防腹瀉效果。目前,關(guān)于β-葡聚糖對(duì)幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響的報(bào)道較多,β-葡聚糖與其他免疫增強(qiáng)劑(如脂多糖)不同,它對(duì)動(dòng)物的食欲、生長(zhǎng)沒有不良影響,并且在飼料中添加β-葡聚糖可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。在19日齡斷奶仔豬的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在飼料中添加0.05%~0.80%的β-葡聚糖可顯著改善仔豬斷奶第14天后的生長(zhǎng)性能,所有β-葡聚糖添加組仔豬的飼料轉(zhuǎn)化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。而另一些研究認(rèn)為β-葡聚糖提高仔豬的生長(zhǎng)速度是由于提高了日采食量,對(duì)ADG和F/G無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌攻毒前,與對(duì)照組相比,酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅均可顯著提高犢牛ADG;同樣,試驗(yàn)各期F/G,添加酵母β-葡聚糖(B組)和桿菌肽鋅(D組)均顯著低于對(duì)照組,而試驗(yàn)各期各組犢牛ADFI均無顯著差異。就本試驗(yàn)來看,在正常的飼養(yǎng)模式下,酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅對(duì)于提高犢牛生長(zhǎng)性能具有相似的效果。本試驗(yàn)中大腸桿菌攻毒后,B、D組ADG顯著高于對(duì)照組,但是與未攻毒組(C組)差異不顯著。同樣的,B、D組F/G顯著低于對(duì)照組,但與未攻毒組差異不顯著(P>0.05)。因此,在本試驗(yàn)攻毒應(yīng)激模式下,酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅可能會(huì)減輕大腸桿菌對(duì)犢牛的損傷,并且與未攻毒組差異不顯著。對(duì)于酵母β-葡聚糖組來說,試驗(yàn)結(jié)果可能是由于在感染前使用β-葡聚糖可增強(qiáng)機(jī)體的免疫清除作用,將抗原抗體反應(yīng)控制在膜免疫局部,減少了全身免疫的負(fù)擔(dān),并且這種免疫保護(hù)作用是以非炎癥的方式來進(jìn)行的,即對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)沒有不良影響。3.2酵母-葡聚糖和桿菌肽鋅的制備對(duì)患者腸道增殖的影響研究證實(shí),大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸桿菌的生理功能與動(dòng)物機(jī)體的生命活動(dòng)息息相關(guān)。本試驗(yàn)在抑制直腸中大腸桿菌增殖上,酵母β-葡聚糖的抑菌效果略低于桿菌肽鋅。這可能是由于酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅在抑制大腸桿菌增殖上的方式不同,桿菌肽鋅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有強(qiáng)烈的抗菌作用,對(duì)部分革蘭氏陰性菌、放線菌、螺旋菌體抑制效果也明顯,其機(jī)制主要為抑制細(xì)菌的細(xì)菌壁合成,也能與敏感細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合,損傷細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外流,從而阻礙腸道內(nèi)細(xì)菌繁殖。而β-葡聚糖主要是在結(jié)腸微生物的作用下生成短鏈脂肪酸,而短鏈脂肪酸能促進(jìn)腸黏膜的生長(zhǎng)。另一方面,β-葡聚糖可通過增加腸道分泌型免疫球蛋白(IgA)的分泌量而減少致病微生物對(duì)腸道的黏附,從而減少大腸桿菌增殖。3.3小鼠腸道功能特性與腸道感染的關(guān)系眾所周知,瘤胃功能的建立是瘤胃內(nèi)容物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸刺激的結(jié)果。Lesmeister等通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)試驗(yàn)所需犢牛數(shù)量、樣品采集部位、樣品采集數(shù)量等進(jìn)行討論,認(rèn)為在評(píng)定瘤胃的指標(biāo)中,瘤胃乳頭的長(zhǎng)度是最重要因素,其次是瘤胃乳頭的寬度和黏膜厚度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,瘤胃乳頭長(zhǎng)度、寬度和黏膜厚度隨飼糧中酵母β-葡聚糖含量的增加而增大,其中酵母β-葡聚糖組顯著高于其余各組,這與前述結(jié)果相一致,其原因可能是β-葡聚糖增加了總揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量,從而刺激瘤胃乳頭發(fā)育有關(guān)。小腸的正常結(jié)構(gòu)是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被充分消化與吸收的基本保證。特別是小腸的絨毛長(zhǎng)度、V/C、黏膜厚度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。腸絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)。絨毛高,則成熟的上皮吸收細(xì)胞多,對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力就強(qiáng),隱窩深度反映了細(xì)胞生成率,隱窩基部向絨毛端部遷移、分化,形成具有吸收能力的絨毛細(xì)胞,以補(bǔ)充絨毛上皮的正常脫落,基部的細(xì)胞生成率降低,使隱窩變淺。V/C綜合反映小腸的功能狀況。比值上升,則黏膜改善,消化吸收功能增強(qiáng);比值下降,消化吸收功能降低,動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育受阻。陳代文等研究表明斷奶仔豬飼糧由母乳轉(zhuǎn)變?yōu)榇槠窌r(shí)如果飼養(yǎng)管理不善,極易加劇腸道對(duì)飼糧的過敏反應(yīng),仔豬小腸表現(xiàn)為嚴(yán)重絨毛脫落、腸黏膜細(xì)胞增生和隱窩細(xì)胞有絲分裂速度加快,進(jìn)而導(dǎo)致了仔豬腹瀉。而張運(yùn)濤等研究表明酵母多糖對(duì)小腸黏膜的具有保護(hù)作用,掃描電鏡觀察表明,對(duì)照組小腸絨毛變形、微絨毛脫落,而