南方根結(jié)線蟲病和象耳豆根結(jié)線侵染不含mi基因的番茄品種的根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)

南方根結(jié)線蟲病和象耳豆根結(jié)線侵染不含mi基因的番茄品種的根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)

番茄是重要的廣東收獲作物。近年來，番茄根結(jié)線蟲meloidoliven已廣泛分布。這是影響番茄生產(chǎn)的主要致病性線蟲。番茄根結(jié)線蟲入侵后，通常減少10%20%，嚴(yán)重?fù)p失30%40%。此外，南方根結(jié)線蟲meloidolonen廣泛分布于中國。這是導(dǎo)致番茄根結(jié)線蟲破壞的主要致病性線蟲。象耳豆根結(jié)線蟲m.銀杏是廣東省的象耳豆樹。據(jù)報(bào)道，它可以在各種作物、熱帶水果和含有mi基因的番茄品種中繁殖。主要分布在海南和廣東。它是中國熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要祖先，也是優(yōu)良群落的趨勢。培育和利用抗蟲番茄品種是控制番茄根結(jié)線蟲危害的理想途徑.Mi基因是目前唯一被商業(yè)化應(yīng)用的番茄抗根結(jié)線蟲的基因,該基因由Watts在南美洲西部沿海的秘魯番茄S.peruvianum上發(fā)現(xiàn)的.Mi基因能有效地抑制南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲M.arenaria和爪哇根結(jié)線蟲M.javanica的繁殖和危害,但對象耳豆根結(jié)線蟲的抑制效果較差.通過檢測番茄是否含有Mi基因,有助于我們選擇合適的品種進(jìn)行種植,從而達(dá)到抗根結(jié)線蟲侵染的目的.檢測Mi基因的方法主要有:檢測與Mi基因緊密連鎖的APS-1同工酶標(biāo)記或REX-1位點(diǎn),或采用RFLP和RAPD的方法進(jìn)行檢測.但由于同工酶標(biāo)記APS-1與番茄的某些不良性狀相連鎖,而且APS等位基因APS-11與APS-1+也會(huì)發(fā)生遺傳重組.Williason等的研究顯示,APS-11和APS-1+都能和Mi或mi基因相連鎖,因此不能用作檢測Mi基因;基于與Mi連鎖的RFLP方法則需要進(jìn)行復(fù)雜的Southern雜交,不適宜進(jìn)行常規(guī)的檢測;RAPD由于結(jié)果不穩(wěn)定,也不能作為檢測Mi基因的手段.酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleavedamplifiedpolymorphicsequences,CAPS)標(biāo)記是特異性引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標(biāo)記.Williason等成功建立CAPS方法檢測與Mi緊密連鎖的REX-1標(biāo)記來檢測Mi基因,能有效避免上述其他方法的缺點(diǎn),適合用于日常的大規(guī)模檢測.于力等采用此方法對Ty-1和Mi基因同時(shí)擴(kuò)增鑒定,但國內(nèi)目前還沒有專門針對番茄Mi基因檢測的報(bào)道.本研究采用CAPS方法對國內(nèi)市場上多個(gè)番茄品種的抗南方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲特性進(jìn)行研究,為生產(chǎn)中選擇合適的番茄品種提供理論依據(jù).1材料和方法1.1材料表面1.1.1馬鈴薯和象耳豆根結(jié)線蟲m.ogiii南方根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita和象耳豆根結(jié)線蟲M.enterolobii均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院植物線蟲研究室提供,保存和繁殖于馬鈴薯Solanumtuberosum根部.1.1.2金寶金寶,夏紅、夏紅26種番茄都是市場購得,分別為:紅麗,TRS-401,特璐絲,仙客1號(hào),仙客5號(hào),夏鉆石,寶石2號(hào),紅豐,石抗一號(hào),金寶,夏紅一號(hào),枝添金六號(hào),紅美人,金鐵霸王,?？怂?金旺6號(hào),金旺3號(hào),夏旺1號(hào),金旺王F1,金旺9號(hào)F1,金鑫,雙金頭三號(hào),雙金頭一號(hào),雙金頭二號(hào),映田紅,夏艷.1.2方法1.2.1pcr反應(yīng)藥品參照Williamson等的方法,采用CTAB法提取.然后貯備在-20℃冰箱中備用.用于PCR反應(yīng)的藥品均購自TaKaRa生物技術(shù)工程有限公司.1.2.2pcr擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)part-gattgagagagagagage,k-ras,k-ro.Mi基因的檢測,參照Williamson等的方法,對與Mi基因緊密連鎖的REX-1位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.引物如下:SCARR:TCG-GAGCCTTGGTCTGAATT,SCARF:GCCAGAGAT-GATTCGTGAGA,均由上海英駿生物工程技術(shù)公司合成.PCR反應(yīng)總體系為20μL,其中包括Buffer2μL,dNTP(10mmol/L)0.4μL,引物(10pmol/μL)各1μL,5U/μLrTaqDNA聚合酶0.2μL,模板DNA1μL,終體積用水加至20μL.擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性5min,然后94℃1min,59℃1min,72℃2min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng).最后72℃延伸10min.擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存.PCR產(chǎn)物于10g/L瓊脂凝膠在電壓5V/cm條件下電泳20min.利用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存.1.2.3序列分析1.2.4植物根結(jié)線蟲接種每種植物材料選擇長勢相當(dāng)(四葉期)的30株,隨機(jī)排列于溫室中,采用灌根法將根結(jié)線蟲的2齡幼蟲分別接種到26種植物材料根部,其中象耳豆根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲各接種15株.接種密度為200條/株.1.2.5番茄抗根結(jié)線蟲病分級(jí)接種后第4周對植物根組織進(jìn)行侵染情況測定,參照劉維志等和馮志新等介紹的次氯酸鈉-酸性品紅染色法進(jìn)行染色計(jì)數(shù).染色后在體視顯微鏡下觀察線蟲侵染情況,并對線蟲侵染后引起的植物根部根結(jié)數(shù)以及侵入根部的雌蟲數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù).番茄抗根結(jié)線蟲病評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照王新榮等的方法:根據(jù)番茄形成根結(jié)的根數(shù)占整個(gè)根系的百分?jǐn)?shù),將番茄抗根結(jié)線蟲病等級(jí)分成免疫、高度抗病、抗病、感病、比較感病和高度感病等6級(jí)(表1).1.2.6處理數(shù)據(jù)2結(jié)果與分析2.1tavi基因回復(fù)突變試驗(yàn)本研究采用PCR與酶切相結(jié)合的方法對26個(gè)不同品種番茄的REX-1位點(diǎn)進(jìn)行檢測,使用特異引物SCARF/SCARR進(jìn)行PCR.結(jié)果顯示,受試的26個(gè)番茄品種都能獲得一條750bp的特異條帶(圖1).但帶有純合和雜合Mi基因的番茄存在TaqI酶切位點(diǎn),經(jīng)酶切后分別產(chǎn)生570、180和750、570和180bp的特異性片段;而不含Mi基因的番茄沒有TaqI酶切位點(diǎn).測序結(jié)果顯示,受試的26個(gè)番茄品種中只有特璐絲、紅麗、TRS-401、仙客1號(hào)和仙客5號(hào)的REX-1位點(diǎn)有TaqI酶切位點(diǎn).酶切結(jié)果顯示,這5個(gè)品種均是純合的Mi基因(圖2),其余21個(gè)品種不含Mi基因.2.2象耳豆根結(jié)率及根結(jié)指數(shù)表2的結(jié)果表明,受試的26個(gè)番茄品種,只有特璐絲、紅麗、TRS-401、仙客1號(hào)和仙客5號(hào)接種南方根結(jié)線蟲后的根結(jié)率均小于5%,根結(jié)指數(shù)為0~4,對南方根結(jié)線蟲高度抗病;但接種象耳豆根結(jié)線蟲后的根結(jié)率為26.7%~45.6%,根結(jié)指數(shù)為56~64,對象耳豆根結(jié)線蟲感病;其余的21個(gè)品種無論是接種南方根結(jié)線蟲或象耳豆根結(jié)線蟲根結(jié)率均為100%,根結(jié)指數(shù)為100,對南方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲高度感病.DMRT分析顯示,5個(gè)含Mi基因的番茄品種接種南方根結(jié)線蟲后,各品種間根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)差異均不顯著(P=0.01),且都顯著小于其余21個(gè)受試的番茄品種(P=0.01);5個(gè)含Mi基因的番茄品種接種象耳豆根結(jié)線蟲后,各品種間根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)差異也不顯著,但顯著小于其余的21個(gè)感病番茄品種.3有機(jī)溶劑與mi基因的微生物表現(xiàn)的關(guān)系本文通過CAPS和人工接種的方法對26種番茄品種的抗南方根結(jié)成蟲和象耳豆根結(jié)線蟲特性進(jìn)行了研究.結(jié)果表明,受試的26個(gè)品種均能擴(kuò)增出一條750bp的特異條帶,但測序結(jié)果顯示只有5個(gè)品種的序列中含有TaqI的酶切位點(diǎn),其余的21個(gè)品種都不含TaqI酶切位點(diǎn),對這5個(gè)品種進(jìn)行酶切,結(jié)果顯示這5個(gè)番茄品種均含純合的Mi基因.接種南方根結(jié)線蟲的試驗(yàn)結(jié)果表明,這5個(gè)番茄品種對南方根結(jié)線蟲高度抗病,而其余21個(gè)番茄品種則高度感病,這證明了REX-1的檢測結(jié)果與接種結(jié)果相吻合.接種結(jié)果進(jìn)一步證明,通過CAPS方法檢測與Mi基因連鎖的REX-1結(jié)果準(zhǔn)確、快速、可靠,能有效地避免APS-1、RAPD和RFLP的缺點(diǎn).另外,接種南方根結(jié)線蟲的結(jié)果顯示,含Mi基因的品種根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)的差異均不顯著,都表現(xiàn)出高度抗南方根結(jié)線蟲的特性;接種象耳豆根結(jié)線蟲后,根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)差異亦不顯著,表現(xiàn)出感病性.這一結(jié)果說明,含Mi基因的番茄品種能有效抵抗南方根結(jié)線蟲的為害,不能有效地阻止象耳豆根結(jié)線蟲為害.但接種象耳豆根結(jié)線蟲后,含有Mi基因的植株與不含Mi基因的植株根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)均差異顯著;盡管都表現(xiàn)為感病,但含有Mi基因的品種根結(jié)指數(shù)和根結(jié)率都要明顯小于不含Mi基因的植株,說明Mi基因能部分地抑制象耳豆根結(jié)線蟲的侵染.劉昊等對番茄、茄子、辣椒、煙草等10種經(jīng)濟(jì)作物15個(gè)品種上象耳豆根結(jié)線蟲的繁殖指數(shù)研究表明,象耳豆根結(jié)線蟲能在含Mi基因的抗性番茄品種Nemarex上繁殖.本研究用象耳豆根結(jié)線蟲接種5個(gè)含Mi基因的不同番茄品種,進(jìn)一步證實(shí)該種根結(jié)線蟲能有效克服Mi基因的抗性,而與番茄的其他遺傳背景無關(guān).其余不含有Mi基因的21個(gè)番茄品種接種南方和象耳豆根結(jié)線蟲后根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)均顯著大于前述的5個(gè)抗性品種,說明不含有Mi基因的植株不能抗南方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲的侵染.綜上所述,目前我國的市場上售賣的番茄栽培品種中僅有少數(shù)含有Mi基因,大部分品種都不含Mi基因.受試的番茄品種中含有Mi基因的都高抗南方根結(jié)線蟲,不含Mi基因的都高感南方根結(jié)線蟲;受試全部番茄都對象耳豆根結(jié)線蟲高度感病或感病,但含Mi基因的番茄的根結(jié)率和根結(jié)指數(shù)都顯著低于不含Mi基因的番茄.因此,在南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種群的地區(qū)應(yīng)盡量選擇含Mi基因的品種栽種,在象耳豆根結(jié)線蟲為害嚴(yán)重的地方,種植抗性品種僅能減少部分為害,應(yīng)該改種象耳豆根結(jié)線蟲不侵染的其他作物或采用化學(xué)防治以及其他防治措施相結(jié)合的方法,