百合知母湯對自然衰老型圍絕經(jīng)期綜合征腎虛證大鼠腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

百合知母湯對自然衰老型圍絕經(jīng)期綜合征腎虛證大鼠腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

百合知母湯來自張仲景的《缺錢要領(lǐng)》，主要治療百合病。百合病雖不能等同于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的圍絕經(jīng)期綜合征,但其所描述的臨床表現(xiàn)與圍絕經(jīng)期綜合征的常見癥狀有明顯的相似之處,百合知母湯已成為目前臨床治療該病的常用方劑。由于百合知母湯具有鎮(zhèn)靜催眠等作用,可以改善絕經(jīng)期綜合征患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀,因此本試驗(yàn)從腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)方面探討百合知母湯治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)理。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物雌性SD大鼠,體重350~550g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬):2007-0005。1.2試劑及儀器百合知母湯濃縮液,含生藥量為0.4g/ml(臨床等效量),由江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;氫化可的松(HVB),天津金耀氨基酸有限公司,批號:0602051;甲狀腺素片(TX),浙江尖峰藥業(yè)有限公司,批號:060703;腺嘌呤(ADE),南京賽吉科技有限公司;甲醇,Tedia.USA,批號707108;無水乙酸鈉,南京化學(xué)試劑廠,批號:05339;檸檬酸,興達(dá)化工試劑廠,批號:990601;辛烷磺酸鈉,東京化成工業(yè)株式會社,批號:FHF01;二正丁胺,常州市光明化學(xué)研究所,批號:960308;乙二胺四乙酸二鈉,汕頭金砂化工廠,批號:010304;高氯酸,上海桃浦化工廠,批號:950504;L-半胱胺酸,惠興生化試劑有限公司,批號:20061128;多巴胺(DA)批號:272212、去甲腎上腺素(NE)批號:253863,均購自Fluka;5-羥色胺(5-HT),Sigma,批號:29H7011;內(nèi)標(biāo),Aldrich,批號:09804HU;PBS緩沖液,檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(PH=6.0),批號:610110066S,DAB試劑盒,批號:703210031,均購自福州邁新;多聚甲醛,上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司,批號:20060806,臨用前用PBS配成4%的多聚甲醛溶液;雙氧水,上海久億化學(xué)試劑有限公司,批號:20070201;即用型SABC免疫組化試劑盒,批號:200708、抗體稀釋液均購自武漢博士德生物工程有限公司。1.3-循環(huán)水式用量泵DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)購自寧波新芝科器研究所;LGR16-W低溫高速離心機(jī)購自北京醫(yī)用離心機(jī)廠;上皿電子天平購自上海精科;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司;LC-10A高效液相色譜儀購自日本島津;TP1020全自動組織處理儀、RM2145石蠟切片機(jī)購自德國LEICA公司;切片漂烘溫控儀購自安徽電子科學(xué)研究所;DP71熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;江蘇捷達(dá)圖像分析軟件。1.4cs、ade、shzmt檢測選取15~16月齡雌性SD大鼠80只,體重350~550g,連續(xù)進(jìn)行陰道涂片15d,取呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期的作為圍絕經(jīng)期大鼠。隨機(jī)分為6組:圍絕經(jīng)期組(cs),cs+BHZMT組,cs+TX腎陰組,cs+TX+BHZMT組,cs+ADE腎陽虛組,cs+ADE+BHZMT組。另取3月齡青年雌鼠作為青年對照組(Normal)。cs+TX腎陰組、cs+TX+BHZMT組大鼠每日同一時(shí)間灌胃TX2.5mg/只,連續(xù)21d,造成腎陰虛模型。cs+ADE腎陽虛組、cs+ADE+BHZMT組大鼠每日同一時(shí)間灌胃ADE200mg/kg,造模全過程為21d,第1~10d每日給藥1次,第10d后隔日給藥,造成腎陽虛模型。1.5給藥劑量及給藥時(shí)間于造模1周后,各組大鼠開始同時(shí)灌胃給藥。cs+BHZMT組、cs+TX+BHZMT組、cs+ADE+BHZMT組按4g/kg劑量給予BHZMT,其余各組給予等量生理鹽水,每日給藥1次,連續(xù)給藥3周。1.6高效液相色譜—NE、DA、5-HT的測定于末次給藥后次日斷頭處死大鼠,于4℃冰臺上迅速分離出下丘腦,液氮冷凍,固化后精確稱重,加入475μl0.1mol·l-1高氯酸(含0.5mmolμL-1的EDTA,47.5ng半胱氨酸)和25μl內(nèi)標(biāo)液,于冰浴下快速玻璃勻漿,4℃條件下15000r/min離心15min,取上清液作為待測樣品。采用高效液相色譜——電化學(xué)法測定樣品中NE、DA、5-HT的含量。流動相參照文獻(xiàn)的方法略作改進(jìn):乙酸鈉:60mmolμL-1;檸檬酸:100mmolμL-1;辛烷磺酸鈉:1.2mmolμL-1;EDTA:0.1mmolμL-1;甲醇∶水=1∶9。流速為1ml/min,柱溫:25℃,進(jìn)樣量:20μl,Ag/AgCl參比電極,工作電壓為+0.75V。1.7腦立體定位片的制備和測定p物質(zhì)和-內(nèi)啡肽含量于末次給藥后次日斷頭處死大鼠,迅速取出大腦,置4%多聚甲醛中固定,上行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,參照包新民等繪制的大鼠腦立體定位圖譜作下丘腦冠狀切片,采用SABC免疫組化方法測定下丘腦中P物質(zhì)和β-內(nèi)啡肽的含量。采用江蘇捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,統(tǒng)計(jì)平均光密度值。1.8統(tǒng)計(jì)處理本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析采用微軟Excel軟件,組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1百合知母湯治療3周后,腎陰虛大鼠n、da和5-ht的變化結(jié)果見表1見表1。圍絕經(jīng)期組大鼠下丘腦NE含量降低、DA和5-HT含量升高,DA/NE和5-HT/NE比值也明顯增加(P<0.05、P<0.01),用百合知母湯治療3周后,上述指標(biāo)改善不明顯。圍絕經(jīng)期腎陰虛大鼠NE、DA和5-HT升高(P<0.01);經(jīng)百合知母湯治療后,含量均明顯下降,其中DA和DA/NE比值有顯著性差異(P<0.05);圍絕經(jīng)期腎陽虛大鼠5-HT含量略有下降,給予百合知母湯后DA和5-HT含量增加,但無顯著性差異。2.2百合知母湯對圍絕經(jīng)期和圍絕經(jīng)期腎陰虛證大鼠體內(nèi)p物質(zhì)含量的影響見表2。圍絕經(jīng)期大鼠下丘腦內(nèi)P物質(zhì)含量明顯升高,β-內(nèi)啡肽含量明顯下降,和青年對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。百合知母湯能降低圍絕經(jīng)期和圍絕經(jīng)期腎陰虛證大鼠下丘腦內(nèi)P物質(zhì)含量,明顯提高β-內(nèi)啡肽含量(P<0.05)。對圍絕經(jīng)期腎陽虛大鼠無明顯作用。3百合知母湯對圍絕經(jīng)期腎陰虛大鼠臨床指標(biāo)的影響在女性生殖系統(tǒng)中β-EP可以抑制GnRH神經(jīng)元活動和LH的分泌,是抑制LH釋放的主要因子,它還可以抑制NE釋放。GnRH神經(jīng)元上沒有性激素受體,而下丘腦弓狀核β-EP神經(jīng)元內(nèi)有雌激素受體(ER)存在,故雌激素在對GnRH進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)中,β-EP起重要作用雌性大鼠的下丘腦、垂體和卵巢中均含有一定量的SP,且SP的含量變化與大鼠的性周期有關(guān)。章功良等發(fā)現(xiàn),下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)中的SP有促進(jìn)睡眠,特別是提高深慢波睡眠的作用。研究還發(fā)現(xiàn),NE在記憶保持方面起重要作用,而改善記憶與促進(jìn)DA的釋放有關(guān),5-HT則參與調(diào)節(jié)情緒、動機(jī)和食欲等。圍絕經(jīng)期婦女由于卵巢功能減退,下丘腦-垂體-性腺軸平衡失調(diào),性激素分泌紊亂,引起植物神經(jīng)功能失調(diào),下丘腦內(nèi)NE、,β-內(nèi)啡肽(β-EP)含量下降、DA、5-HT和P物質(zhì)(SP)含量明顯增高,進(jìn)而出現(xiàn)潮熱、多汗、煩躁不安、失眠等癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)百合知母湯能明顯降低圍絕經(jīng)期綜合征腎陰虛大鼠升高的DA含量和DA/NE比值,對NE和5-HT也有調(diào)節(jié)作用,但對圍絕經(jīng)期腎陽虛大鼠卻無明顯的改善作用,由此我們認(rèn)為百合知母湯具有部分糾正圍絕經(jīng)期腎陰虛大鼠中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂的作用,從而達(dá)到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng),緩解圍絕經(jīng)期陰虛內(nèi)熱、煩躁不安、失眠等癥狀的目的。以往研究發(fā)現(xiàn),給予中藥治療后可以提高圍絕經(jīng)期大鼠下丘腦β-EP含量,降低SP水平,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致,百合知母湯可以下調(diào)圍絕經(jīng)期和圍絕經(jīng)期腎陰虛證