腫瘤抗原特異性細胞的分離、鑒定和鑒定

腫瘤抗原特異性細胞的分離、鑒定和鑒定

wolf等人提出了一種表面標記方法，以cd137為表面標記，快速確定和分離人們sd8t細胞的特定異體細胞。由于CD137分子表達于活化的CD4+和CD8+T細胞表面,其表達上調依賴于T細胞經抗原刺激后活化,并可在抗原刺激后12h~5d內持續(xù)表達。因此可以CD137為標記,從T細胞中檢測和分離比例較低的抗原特異性T細胞。上述研究主要從健康人外周血單核細胞(peripheralbloodmonocyte,PBMC)中篩選CD137+抗原特異性T細胞。然而由于成熟的外周血T細胞經歷了胸腺的陰性選擇,其T細胞抗原受體(Tcellreceptor,TCR)對自身抗原肽(接近腫瘤抗原肽)/MHC復合物的親和力低下,限制了以健康人PBMC篩選腫瘤抗原特異性T細胞的效率。因此,有必要尋找更理想的腫瘤抗原特異性T細胞篩選來源,這一來源應較為確定地含有可識別腫瘤相關抗原的T細胞亞群。國外臨床研究結果提示,腫瘤局部浸潤的記憶性T細胞數量,與患者的預后和轉歸有明顯相關性。提示腫瘤浸潤記憶性T細胞可在局部識別腫瘤抗原進而發(fā)揮抗腫瘤免疫效應。尤其是記憶性T細胞中的中樞型記憶性T細胞(centralmemoryTcell,TCM)亞群可在體內長期存活,并保持其抗原特異性。因此,來源于腫瘤浸潤淋巴細胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)中的記憶性T細胞,特別是TCM有望為腫瘤抗原特異性T細胞提供更高效的篩選來源。本實驗首先從肝癌患者腹水TIL中純化獲得含有TCM成分的CD8+CD62L+T細胞。選擇CD62L為純化標志的理由是:(1)CD62L是初始T細胞和TCM的共同標記。經CD62L純化可排除已經抗原刺激活化,但抗原特異性未知的活化T細胞和效應型記憶性T細胞(effectormemoryTcell,TEM)。(2)由于TIL細胞數量有限,并預先經過了CD8磁珠分選。純化步驟過多將極大增加細胞損失數量,影響最終獲得抗原特異性T細胞的數量。在純化獲得CD8+CD62L+T細胞后,我們鑒定了其中的TCM比例。隨后以肝癌相關抗原AFP九肽刺激CD8+CD62L+T細胞。以CD137+T細胞比例明確了抗原特異性T細胞活化程度后,最終通過磁珠純化獲得了針對AFP抗原肽的特異性T細胞。1材料和方法1.1材料表面1.1.1樣本HLA-A2+AFP+肝癌患者腹水樣本由東莞市人民醫(yī)院腫瘤內科收集,患者簽署知情同意書。抽取HLA-A2+健康志愿者外周血樣本。1.1.2細胞植物1.1.3抗bp218-1337RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產品;人淋巴細胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限責任公司產品;重組人IL-2、IL-15為美國R&D公司產品;HLA-A2限制性AFP218-226表位9肽(LLNQHACAV)由杭州中肽生化有限公司合成;PC5標記抗人CD8抗體、FITC標記抗人CD62L抗體、PE標記抗人CD44抗體、ECD標記抗人CD45RO抗體、PE標記抗人CD137抗體均購自美國BioLegend公司;CD8陰選磁珠試劑盒、CD62L陽選磁珠試劑盒、CD137陽選磁珠試劑盒均購自德國Miltenyi公司。1.2方法1.2.1細胞分離和細胞分離取新鮮抽取的HLA-A2+AFP+肝癌患者腹水樣本,與無菌生理鹽水按1:1的比例稀釋并混勻,加入淋巴細胞分離液,Ficoll-Hapaque密度梯度離心法分離單個核細胞。1.2.2人類pbmc分離1.2.3cd8+t細胞純化腹水TIL及健康人PBMC分離當天,以免疫磁珠法完成CD8+T細胞純化。根據試劑盒說明書完成操作。本步磁珠分離為陰選(雜細胞結合磁珠被吸附于分選柱,收集未結合磁珠而流出的CD8+T細胞)。1.2.5cd45ro抗體染色PC5標記CD8抗體、FITC標記CD62L抗體、PE標記CD44抗體、ECD標記CD45RO抗體染色后上機。檢測CD8+CD62L+T細胞中以上4種分子表達陽性的細胞比例。1.2.6mol/l刺激活化T2細胞負載HLA-A2限制性AFP218-226表位9肽(1μmol/L)刺激活化分別來源于肝癌患者TIL和健康人PBMC的CD8+CD62L+T細胞(數量為5×106~1×107個,與T2細胞數量比例為5:1)。在T細胞分離后于第3和第6天進行兩輪刺激。1.2.7流式細胞術檢測第2輪抗原肽刺激24h后。PE標記CD137抗體染色,流式細胞術檢測分別來源于肝癌患者TIL和健康人PBMC的CD8+CD62L+T細胞經抗原刺激后CD137+T細胞比例,并以免疫磁珠法完成CD137+T細胞純化。2結果2.1cd62l+t細胞純化以CD8陰選磁珠從來自肝癌患者腹水TIL和健康人外周血PBMC中(各完成3個樣本)純化CD8+T細胞,純度均高于95%。本步選擇陰選磁珠的目的是避免CD8+T細胞與抗體包被磁珠結合,影響下一步CD62L+T細胞純化。獲得CD8+T細胞后,于當日內完成第二步CD62L+陽選磁珠純化,獲得分別來自肝癌患者腹水TIL和健康人外周血PBMC的CD8+CD62L+T細胞,純度>95%(圖1)。2.2tcm比例的檢測通過CD62L磁珠純化,排除了CD8+T細胞中CD62L陰性表達的活化T細胞和TEM。以CD45RO和CD44為表面標記,實驗進一步檢測了CD8+CD62L+T細胞中TCM(表型為CD45RO+CD44high)及初始T細胞(CD45RO-CD44-)比例。如圖2結果所示,來源于肝癌患者腹水的TIL和健康人PBMC的CD8+CD62L+T細胞都存在一定比例的TCM。其中TIL來源CD8+CD62L+T細胞中的TCM比例較高,但尚需要完成更多樣本的檢測以得出明確結論。2.3：原理4細胞控制率檢測主體細胞系統(tǒng)中cd8+cd62l+t細胞的表達以TAP缺陷性T2細胞株(僅遞呈外源性抗原肽)負載AFP218-226表位9肽,刺激來源于肝癌患者腹水TIL和健康人PBMC的CD8+CD62L+T細胞(各完成3例)。如圖3結果所示,抗原肽刺激后,腹水TIL來源CD8+CD62L+T細胞有較高的CD137+T細胞比例(介于7%~25%)(圖3A~C)。與之相比,健康人PBMC來源CD8+CD62L+T細胞經抗原刺激后CD137+T細胞比例較低(小于4%)(圖3D~F)。2.4cd62l+t細胞純化以CD137磁珠對上述各3例經AFP抗原刺激的肝癌患者腹水TIL和健康人PBMC來源CD8+CD62L+T細胞完成純化。從其中兩例肝癌患者腹水TIL來源CD8+CD62L+T細胞中純化獲得了CD137+T細胞,純度大于95%(圖4)。數量級約在105。而健康人PBMC來源CD8+CD62L+T細胞由于比例較低,幾乎難以通過磁珠純化獲得CD137+T細胞。3腫瘤人體內t細胞的表達及純化分離獲得可以高親和力與腫瘤抗原結合的特異性CD8+T細胞是提高腫瘤免疫治療效果的重要基礎。然而由于外周血中的成熟T細胞在發(fā)育過程中經歷了胸腺的陰性選擇,使能夠和腫瘤抗原(由于腫瘤免疫編輯,其成分接近正常組織細胞表達的分化抗原)高親和力結合的T細胞被清除。因此從腫瘤患者體內獲得足夠數量的抗原特異性T細胞難度較大。研究者早就發(fā)現(xiàn),與缺乏腫瘤抗原識別功能的外周血T細胞不同,腫瘤局部浸潤的TIL提示了宿主對腫瘤的免疫反應。特別是TIL中的CD8+T細胞可能與腫瘤良好預后直接相關。而關于腫瘤局部浸潤記憶性T細胞的研究更是為解決腫瘤抗原特異性T細胞來源的問題提供了一條可能的思路。由于腫瘤局部浸潤高水平的CD45RO+記憶性T細胞提示了更少的早期惡性侵襲標志,更慢的病理進展進程和更長的生存期。提示腫瘤患者體內部分記憶性T細胞可在局部提供較長期的抗腫瘤免疫保護。通過選擇免疫功能相對較為確定的腫瘤浸潤記憶性T細胞作為篩選來源,可望有效提高腫瘤抗原特異性T細胞的篩選效率。本實驗收集HLA-A2陽性AFP抗原表達陽性的肝癌患者腹水,從中分離出TIL。隨后進行CD8+及CD62L+兩步磁珠純化,獲得CD8+CD62L+T細胞。完成磁珠純化后,以CD45RO和CD44為標志分子,實驗進一步檢測了CD8+CD62L+T細胞中初始T細胞和TCM的亞群比例。結果證實,來源于腫瘤患者TIL的CD8+CD62L+T細胞存在著一定比例的CD45RO+CD44highTCM。實驗隨后以腫瘤相關抗原AFP抗原肽刺激了肝癌患者TIL來源及健康人PBMC來源的CD8+CD62L+T細胞。以上抗原9肽已被證實可在體外有效刺激T細胞活化并產生CTL效應(HLA-A2限制性)。結果顯示,肝癌患者TIL來源CD8+CD62L+T細胞經抗原刺激后,可以觀察到較為明顯的CD8+CD137+細胞亞群。而健康人PBMC來源CD8+CD62L+T細胞經抗原刺激后CD137+細胞比例較低。由于腫瘤患者初始T細胞難以有效識別腫瘤抗原,最終接觸腫瘤抗原肽刺激被有效活化的抗原特異性T細胞可能主要來源于CD8+CD62L+T細胞中的CD45RO+CD44highTCM。以上結果提示,與正常人PBMC相比,腫瘤患者TIL來源CD8+CD62L+細胞中存在著可識別腫瘤抗原的TCM,并在腫瘤抗原刺激后活化產生抗原特異性T細胞,從而在腫瘤局部提供有效的免疫保護。在腫瘤相關抗原肽刺激并明確CD137+T細胞活化比例后,實驗最終通過磁珠分選,從兩例肝癌患者TIL中純化獲得了一定數量可識別AFP抗原肽的CD137+抗原特異性T細胞。通過本實驗所建立的方法,為進一步大量擴增抗原特異性T細胞,并通過分子生物學方法從抗原特異性T細胞中鑒定腫瘤抗原特異性TCR基因奠定了必要的實驗基礎。人TAP缺陷T2細胞株為本實驗室保存。抽取HLA-A2+健康人靜脈血,Ficoll-Hapaque密度梯度離心法分離PBMC。1.2.4cd8+cd62l+t細胞的制備以免疫