中國(guó)HIV-1-BED新發(fā)感染檢測(cè)監(jiān)測(cè)方案 -110330

中國(guó)HIV-1_BED新發(fā)感染檢測(cè)監(jiān)測(cè)方案-110330HIV-1新發(fā)感染血清學(xué)方法檢測(cè)方案〔試行〕中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心二〇一一年三月

前 言了解HIV-1新發(fā)感染率，對(duì)于預(yù)測(cè)疫情變化趨勢(shì)、評(píng)估防治效果，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。近幾年，美國(guó)CDC創(chuàng)造了一種血清學(xué)方法〔BED－EIA法〕，用于HIV-1新發(fā)感染檢測(cè)。與傳統(tǒng)的隊(duì)列方法比擬，該捕獲酶聯(lián)免疫法簡(jiǎn)單，本錢(qián)低廉，易于普及，比隊(duì)列方法更加具有可操作性和實(shí)用性，可以在開(kāi)展感染率監(jiān)測(cè)的同時(shí)進(jìn)行新發(fā)感染率監(jiān)測(cè)。美國(guó)CDC已于2024年將其納入國(guó)家常規(guī)監(jiān)測(cè)體系,全球數(shù)十個(gè)國(guó)家不同程度的將該方法應(yīng)用于新發(fā)感染檢測(cè)。由于各國(guó)流行的HIV-1亞型及感染狀況有所不同，UNAIDS建議各國(guó)首先進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)，獲得當(dāng)?shù)氐暮诵募夹g(shù)參數(shù)后再納入應(yīng)用。中國(guó)CDC性病艾滋病預(yù)防控制中心，在國(guó)家十一五科技攻關(guān)重大工程和美國(guó)CDC的支持下，自2024年開(kāi)始對(duì)BED方法，進(jìn)行了系統(tǒng)研究與評(píng)價(jià)，獲得在我國(guó)使用該方法的核心技術(shù)參數(shù)〔新發(fā)感染窗口期及新發(fā)感染計(jì)算校正系數(shù)〕，建立了相應(yīng)的質(zhì)控體系，在并在16個(gè)省高危人群中開(kāi)展了HIV-1新發(fā)感染檢測(cè)的試點(diǎn)工作。為進(jìn)一步在全國(guó)更加標(biāo)準(zhǔn)、有效地開(kāi)展HIV-1新發(fā)感染檢測(cè)，在總結(jié)試點(diǎn)工作經(jīng)驗(yàn)的根底上，經(jīng)過(guò)全國(guó)HIV新發(fā)感染檢測(cè)工作組屢次討論，廣泛征求各級(jí)實(shí)驗(yàn)室、流行病和管理等人員意見(jiàn)和建議的根底上，歷時(shí)數(shù)年，制定、完成了?HIV-1新發(fā)感染血清學(xué)方法檢測(cè)方案?〔以下簡(jiǎn)稱(chēng)?方案?〕。本?方案?共分十三局部，包括：背景，目的，方法，范圍及人群，操作流程，相關(guān)信息收集，檢測(cè)樣品入選，排除標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)要求，BED檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序，數(shù)據(jù)分析，結(jié)果反響，質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)使用和管理，任務(wù)分工。本?方案?上報(bào)衛(wèi)生部，經(jīng)獲準(zhǔn)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)至各省疾病預(yù)防控制中心及有關(guān)單位。本?方案?將作為技術(shù)指導(dǎo)性文件，為各省開(kāi)展HIV-1新發(fā)感染檢測(cè)工作，提供強(qiáng)有力的支持。本?方案?起草單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心。本?方案?參加編寫(xiě)單位：云南省疾病預(yù)防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心、四川省疾病預(yù)防控制中心、河南省疾病預(yù)防控制中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、江蘇疾病預(yù)防控制中心、湖南省疾病預(yù)防控制中心、重慶疾病預(yù)防控制中心、廣東省疾病預(yù)防控制中心、廣西疾病預(yù)防控制中心、。本?方案?編寫(xiě)組人員：蔣巖、汪寧、肖瑤、沈圣、王璐、王嵐、賈曼紅、段松、倪明健、董永慧、秦光明、崔為國(guó)、潘曉紅、郭志宏、盧紅燕、還錫萍、陳曦、林華、林鵬、劉偉、邱茂峰胡紅。本?方案?主要國(guó)際技術(shù)參謀：美國(guó)疾病預(yù)防控制中心GAP工程〔MarcBulterys，BharatS.Parekh，OuChin-Yih〕和世界衛(wèi)生組織北京辦〔張嵐〕。本?方案?編寫(xiě)工作聯(lián)系人：肖瑤。本?方案?自發(fā)布之日起實(shí)施，?方案?解釋權(quán)屬于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。 HIV新發(fā)感染檢測(cè)工作組 2011年3月3日目 錄TOC\o"1-1"\h\z\u1 背景 背景近年來(lái)，隨著實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的開(kāi)展，使得用血清學(xué)方法監(jiān)測(cè)HIV-1新發(fā)感染成為可能ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>沈圣</Author><Year>2024</Year><RecNum>506</RecNum><record><rec-number>506</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="pfvs0rf59wtpfre09wt52tr7ftfxsrsaefff">506</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">沈圣</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">蔣巖</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"size="100%">HIV</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">新近感染檢測(cè)方法研究進(jìn)展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">中華流行病學(xué)雜志</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>中華流行病學(xué)雜志</full-title></periodical><pages><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">102-105</style></pages><volume><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">31</style></volume><number>4</number><dates><year>2024</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"沈圣,2024#506"1]。這些方法可以區(qū)分HIV-1新發(fā)感染和長(zhǎng)期感染，獲得國(guó)家/地區(qū)新發(fā)感染率。目前，各國(guó)研究的血清學(xué)方法有十余種，其中經(jīng)過(guò)系統(tǒng)評(píng)價(jià)、應(yīng)用最廣的是美國(guó)疾病預(yù)防控制中心建立的BEDHIV-1捕獲酶聯(lián)法〔BED方法〕。該方法是通過(guò)測(cè)定HIV-1特異性IgG占總IgG抗體的比例，確定是否新發(fā)感染ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Parekh,2024#32"2,HYPERLINK\o"Dobbs,2024#199"3]。因此對(duì)抗體水平〔感染時(shí)間的長(zhǎng)短〕較敏感ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Parekh</Author><Year>2001</Year><RecNum>37</RecNum><record><rec-number>37</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="pfvs0rf59wtpfre09wt52tr7ftfxsrsaefff">37</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>BharatS.Parekh</author><author>J.StevenMcDougal</author></authors></contributors><titles><title>NewapproachesfordetectingrecentHIV-1infection</title><secondary-title>AIDSReviews</secondary-title></titles><periodical><full-title>AIDSReviews</full-title></periodical><pages>183-193</pages><volume>3</volume><dates><year>2001</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Parekh,2001#37"4]。在個(gè)體水平上由于抗體產(chǎn)生的差異，可能產(chǎn)生一定的假陽(yáng)性和假陰性，但在人群水平上，假陽(yáng)性數(shù)目與假陰性數(shù)目相近，可以相互抵消彼此的作用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Parekh,2024#32"2]。該方法的應(yīng)用，嚴(yán)格限制于人群新發(fā)感染率估計(jì)，結(jié)果不能反響個(gè)體或其監(jiān)護(hù)人及監(jiān)管場(chǎng)所。由于各亞型HIV-1新發(fā)感染的窗口期—即從標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)法檢測(cè)抗體為陽(yáng)性至預(yù)先設(shè)定的BED方法的標(biāo)準(zhǔn)化光密度值所需要的時(shí)間，略有不同，也為了更加有效地使用該方法，UNAIDS建議各國(guó)在使用之前進(jìn)行評(píng)估，獲得適宜的窗口期和校正系數(shù)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Year>2024</Year><RecNum>67</RecNum><DisplayText>[5]</DisplayText><record><rec-number>67</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="er2w5ev5ff2ftyea9se50zdse290a0rv92pt">67</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title>UNAIDSReferenceGrouponestimates,modellingandprojections--statementontheuseoftheBEDassayfortheestimationofHIV-1incidenceforsurveillanceorepidemicmonitoring</title><secondary-title>WklyEpidemiolRec</secondary-title></titles><periodical><full-title>WklyEpidemiolRec</full-title></periodical><pages>40</pages><volume>81</volume><number>4</number><edition>2024/05/05</edition><keywords><keyword>Africa/epidemiology</keyword><keyword>HIVInfections/*epidemiology</keyword><keyword>*HIV-1/immunology</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>*ImmunoenzymeTechniques</keyword><keyword>Incidence</keyword><keyword>PopulationSurveillance</keyword></keywords><dates><year>2024</year><pub-dates><date>Jan27</date></pub-dates></dates><isbn>0049-8114(Print) 0049-8114(Linking)</isbn><accession-num>16671237</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/16671237</url></related-urls></urls><language>eng fre</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o",2024#67"5]。從2001到2024年，美國(guó)CDC先后舉行了5次專(zhuān)家咨詢會(huì)，區(qū)建立了技術(shù)平臺(tái)和質(zhì)控體系，探討了以IDU人群為主的新發(fā)感染檢測(cè)/監(jiān)測(cè)模式，積累了經(jīng)驗(yàn)，也為試點(diǎn)地區(qū)了解HIV-1疫情提供了科學(xué)參考。2024年試點(diǎn)工作擴(kuò)大至15省〔新增福建、河北、山東、上海、江蘇、陜西、河南和北京〕。除IDU人群外，局部地區(qū)在MSM，暗娼、性病門(mén)診、孕產(chǎn)婦和婚檢人群中也陸續(xù)開(kāi)始了新發(fā)感染檢測(cè)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Jiang,2024#54"15,HYPERLINK\o"Duan,2024#45"19-23]。2024到2024年，性病艾滋病預(yù)防控制中心舉行了屢次專(zhuān)家咨詢會(huì)及新發(fā)感染檢測(cè)/監(jiān)測(cè)工作組會(huì)議，討論了在中國(guó)開(kāi)展新發(fā)感染檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方法。監(jiān)測(cè)、統(tǒng)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室、臨床和綜合管理方面的專(zhuān)家，WHO、中美GAP、中默艾滋病及中蓋艾滋病等工程的技術(shù)人員，共同研討后確定了該方法在中國(guó)的使用方案。2024年開(kāi)始，擬將該方法擴(kuò)大至全國(guó)大局部地區(qū)哨點(diǎn)重點(diǎn)人群和局部病例報(bào)告系統(tǒng)，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的適用性和有效性。為了有效開(kāi)展新發(fā)感染檢測(cè)工作，特制定本方案。主要內(nèi)容包括：應(yīng)用BED方法進(jìn)行新發(fā)感染檢測(cè)的目的，方法，范圍及人群，操作流程，相關(guān)信息收集，檢測(cè)樣品入選及排除標(biāo)準(zhǔn)，BED標(biāo)準(zhǔn)操作程序，數(shù)據(jù)分析，結(jié)果反響，質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)使用、管理，任務(wù)分工。2 目的2.1了解重點(diǎn)人群HIV-1新發(fā)感染情況，為估計(jì)艾滋病流行形勢(shì)和判斷疫情變化提供科學(xué)依據(jù)。2.2 了解HIV-1新發(fā)感染在新發(fā)現(xiàn)感染者中的比例ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"王繼寶,2024#72"24]，探討我國(guó)病例報(bào)告新發(fā)感染檢測(cè)的適用性。3 方法3.1 樣品和信息：來(lái)源于哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)和病例報(bào)告系統(tǒng)；3.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)：使用BED方法；3.3 數(shù)據(jù)分析：根據(jù)哨點(diǎn)重點(diǎn)人群監(jiān)測(cè)新發(fā)現(xiàn)感染者樣品的BED檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合流行病學(xué)相關(guān)資料，計(jì)算重點(diǎn)人群HIV-1新發(fā)感染率,并進(jìn)行適當(dāng)矯正；根據(jù)病例報(bào)告系統(tǒng)新報(bào)告感染者樣品的BED檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算新發(fā)感染者占新報(bào)告感染者的比例，并根據(jù)相關(guān)背景信息，綜合分析新發(fā)感染情況。4 范圍及人群4.1 各省/自治區(qū)/直轄市每年監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)新報(bào)告的重點(diǎn)人群所有HIV-1感染者樣品；4.2 各省/自治區(qū)/直轄市每年病例報(bào)告新發(fā)現(xiàn)的所有HIV-1感染者樣品。根本要求是覆蓋第二季度新發(fā)現(xiàn)的所有感染者樣品。各省可以根據(jù)年度發(fā)現(xiàn)的感染者總量，決定進(jìn)行BED檢測(cè)的樣品量，如第二季度總樣品量太少，可以考慮覆蓋更長(zhǎng)時(shí)段，個(gè)別樣品總量很少的地區(qū)，可以考慮覆蓋全年。5 操作流程各省新發(fā)感染檢測(cè)集中在確證中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。各確證中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果須與國(guó)家參比室檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，復(fù)核后使用。具體流程如下：5.1 哨點(diǎn)新報(bào)告重點(diǎn)人群感染者樣品的新發(fā)感染檢測(cè)流程〔圖一〕各哨點(diǎn)采集5ml血液樣品，統(tǒng)一編號(hào)，連同問(wèn)卷一并送至艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性樣品由確證實(shí)驗(yàn)室保存，分裝〔均分為兩管，每管0.5ml〕，將兩管樣品與送檢單〔附件一〕一并送至確證中心實(shí)驗(yàn)室。確證中心實(shí)驗(yàn)室檢查、復(fù)核全省哨點(diǎn)陽(yáng)性樣品，對(duì)符合BED檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并綜合分析檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算HIV-1新發(fā)感染率。各省確證中心實(shí)驗(yàn)室，須按照時(shí)間要求上報(bào)結(jié)果，上報(bào)內(nèi)容包括：BED數(shù)據(jù)處理表、重點(diǎn)人群HIV-1新發(fā)感染率和附件二。參比室負(fù)責(zé)比對(duì)分析省確證中心實(shí)驗(yàn)室與參比室檢測(cè)結(jié)果，分析、確認(rèn)后將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)交流病室，與哨點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)接，綜合分析結(jié)果。相關(guān)結(jié)果經(jīng)新發(fā)感染檢測(cè)/監(jiān)測(cè)工作組會(huì)議討論通過(guò)后，上報(bào)中國(guó)CDC和衛(wèi)生部，同時(shí)反響各省。圖一 哨點(diǎn)新報(bào)告感染者樣品的新發(fā)感染檢測(cè)流程5.2 病例報(bào)告新發(fā)現(xiàn)感染者樣品的新發(fā)感染檢測(cè)流程〔圖二〕省確證中心實(shí)驗(yàn)室收集當(dāng)年病例報(bào)告新發(fā)現(xiàn)感染者樣品，對(duì)符合BED檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，分析BED檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算HIV-1新發(fā)感染比例，即BED方法判斷為新發(fā)感染的樣品占進(jìn)行檢測(cè)的所有新發(fā)現(xiàn)感染者樣品總數(shù)的比例。按照時(shí)間要求將結(jié)果上報(bào)參比室，上報(bào)內(nèi)容包括：BED數(shù)據(jù)處理表、重點(diǎn)人群HIV-1新發(fā)感染比例和附件三。參比室對(duì)檢測(cè)結(jié)果及質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)核、確認(rèn)后，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)流病室，與病例報(bào)告數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)接，分析結(jié)果。相關(guān)結(jié)果經(jīng)新發(fā)感染檢測(cè)工作組會(huì)議討論通過(guò)后，上報(bào)中國(guó)CDC和衛(wèi)生部，同時(shí)反響各省。 圖二 病例報(bào)告新報(bào)告的感染者樣品新發(fā)感染檢測(cè)流程5.3 年度工作進(jìn)度每年新發(fā)感染檢測(cè)/監(jiān)測(cè)工作時(shí)間表：5月試劑下發(fā)各省。8月各省完成病例報(bào)告樣品檢測(cè)，上報(bào)檢測(cè)結(jié)果；9月各省完成哨點(diǎn)陽(yáng)性樣品檢測(cè)，同時(shí)將第二份樣品及信息寄至國(guó)家參比室，并上報(bào)結(jié)果。6 相關(guān)信息收集6.1 哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)樣品相關(guān)信息的收集各省CDC負(fù)責(zé)收集哨點(diǎn)樣品相關(guān)信息，包括哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)編號(hào)和病例報(bào)告系統(tǒng)卡片ID號(hào)〔如果有〕。6.2 病例報(bào)告系統(tǒng)樣品相關(guān)信息的收集通過(guò)與病例報(bào)告記錄進(jìn)行核對(duì)，了解是否有艾滋病相關(guān)病癥、是否正在使用或曾經(jīng)使用抗病毒治療藥物、既往是否做過(guò)HIV-1檢測(cè)、第一次確證陽(yáng)性時(shí)間以及是否進(jìn)行CD4檢測(cè)等，將明確的“長(zhǎng)期感染〞排除，并對(duì)可能的影響因素進(jìn)行分析。7 檢測(cè)樣品入選、排除標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)要求7.1 入選標(biāo)準(zhǔn)7.1.1 新發(fā)感染檢測(cè)必須應(yīng)用診斷為HIV-1陽(yáng)性的樣品，禁止將HIV-1陰性樣品納入新發(fā)感染檢測(cè)。7.1.2 每份樣品量不少于1mL。樣品要求清亮、無(wú)嚴(yán)重溶血、沒(méi)有交叉污染，必須保存在-20℃以下，反復(fù)凍融次數(shù)不多于三次。7.2 排除標(biāo)準(zhǔn)7.2.1 如果同一人在六個(gè)月以內(nèi)出現(xiàn)兩份或兩份以上確認(rèn)陽(yáng)性樣品，將第一份樣品納入新發(fā)感染檢測(cè)，其余樣品從總樣品中刪除。7.2.2 所有艾滋病病人樣品。7.2.3 所有接受抗病毒治療的HIV-1感染者樣品。7.3 相應(yīng)要求7.3.1 對(duì)于哨點(diǎn)樣品，進(jìn)行新發(fā)感染檢測(cè)的樣品量必須占應(yīng)檢測(cè)陽(yáng)性樣品的85%以上，否那么不納入新發(fā)感染檢測(cè)。7.3.2 哨點(diǎn)樣品必須具有哨點(diǎn)問(wèn)卷編號(hào)，并盡可能補(bǔ)充病例報(bào)告系統(tǒng)卡片ID號(hào)。病例報(bào)告樣品應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)病例報(bào)告系統(tǒng)卡片ID號(hào)。8 BED檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序8.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備8.1.1 將主要試劑，包括稀釋緩沖液〔DiluentBuffer〕、10×洗液〔WashBuffer〕、對(duì)照及樣品8.1.2 1×濃度洗滌緩沖液〔1×WashBuffer〕的制備：將100mL10×濃度的緩沖液與900mL的去離子水混合，用磁力攪拌棒混合至少10min。未用的緩沖液在4℃可保存一周，之后8.2 實(shí)驗(yàn)操作〔初篩實(shí)驗(yàn)〕8.2.1 根據(jù)板上的布局，在滴定管中將對(duì)照和樣品分別稀釋100倍：吸取500μL稀釋液DiluentBuffer到每個(gè)試管〔多道或單道槍〕，按照初篩實(shí)驗(yàn)板子的布局〔見(jiàn)圖三〕，分別參加5μL對(duì)照或樣品到相應(yīng)的管中。陰性對(duì)照稀釋2份和余下的對(duì)照(CAL，LPC，HPC)稀釋3份。初篩實(shí)驗(yàn)時(shí),每個(gè)的樣品稀釋一份。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣品稀釋三份。對(duì)照和校準(zhǔn)品在使用完畢后必須迅速放回NCHPC6142230384654627078NCHPC7152331394755637179CALHPC8162432404856647280CAL19172533414957657381CAL210182634425058667482LPC311192735435159677583LPC412202836445260687684LPC513212937455361697785圖三 BED初篩實(shí)驗(yàn)板子布局圖8.2.2 用多通道移液器小心地吹打稀釋的對(duì)照和樣品5次，然后吸取100μL移至微孔板中，將平板密封，8.2.3 孵育結(jié)束前的10分鐘，將HIV-1生物素-抗原肽試劑用稀釋緩沖液DiluentBuffer稀釋1000倍。用后放置在≤每個(gè)平板:在12mL稀釋緩沖液DiluentBuffer中參加12μLHIV-1生物素-抗原肽〔用前渦旋混勻〕。渦旋充分?jǐn)噭蚧旌?。局部平?對(duì)于每個(gè)8孔板條，在1mL稀釋緩沖液DiluentBuffer中參加1μLHIV-1生物素-抗原肽。渦旋充分?jǐn)噭蚧旌稀?.2.4 用96孔或帶式洗板機(jī)，沖洗4次〔沖洗2次然后將平板旋轉(zhuǎn)后再?zèng)_洗2次〕，每孔300μL洗滌緩沖液1×8.2.5 用多通道移液器在每孔中參加100μLHIV-1生物素-抗原肽，密封，37℃.7 鏈親和素－過(guò)氧化物酶結(jié)合物用稀釋緩沖液DiluentBuffer稀釋1000倍。用后放置在≤每個(gè)平板：渦旋含鏈親和素－過(guò)氧化物酶〔Streptavidin－HRP〕的小瓶，在12mL稀釋緩沖液中參加12μL鏈親和素－過(guò)氧化物酶；充分渦旋混合。局部平板：對(duì)于每個(gè)板條〔8孔〕，在1mL稀釋緩沖液中參加1μL鏈親和素－過(guò)氧化物酶；充分渦旋混合。8.2.8 用多通道移液器在每孔中參加100μL稀釋的結(jié)合物，密封，.108.2.11確保TMB底物已達(dá)室溫。用多通道移液器在每孔中參加100μLTMB底物(不要密封)，25℃. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果8.3.1 確定對(duì)照和校準(zhǔn)品的中值OD〔中值OD為3次OD值排序后中間的值〕，對(duì)照和校準(zhǔn)品的中值OD值必須在下表范圍內(nèi)，該試驗(yàn)才有效。兩個(gè)NCNCCALLPCHPC最小值0.0000.5000.2000.900最大值0.2501.2000.8002.2008.3.2對(duì)照的ODn值＝對(duì)照的中值OD/校準(zhǔn)品的中值OD初篩中：各樣品的ODn值＝各樣品的OD值/校準(zhǔn)品的中值OD確認(rèn)中：各樣品的ODn值＝各樣品的中值OD值/校準(zhǔn)品的中值OD8.3.3NCCALLPCHPC最小值0.0001.0000.4001.200最大值0.3001.0000.7501.9008.4確認(rèn)實(shí)驗(yàn)ODn值≤1.2時(shí)，分成三份重復(fù)檢測(cè)，試驗(yàn)步驟同初篩步驟。板子布局如圖四所示。NCHPC25810131618212426NCHPC35811131619212427CALHPC36811141619222427CAL136911141719222527CAL146912141720222528LPC147912151720232528LPC2471012151820232628LPC25710131518212326BL**BL＝空白圖四 BED確認(rèn)實(shí)驗(yàn)板子布局圖8.5結(jié)果的解釋在中國(guó)的研究說(shuō)明，BED的ODn為0.8時(shí)，可以指明平均血清陽(yáng)轉(zhuǎn)時(shí)間為168天。ODn為0.8時(shí)可以減少AIDS病人錯(cuò)分為近期感染的幾率，進(jìn)而得到較好的近期感染的預(yù)測(cè)值。在初篩中樣品為單份檢測(cè)，其ODn值≤1.2時(shí)，分成三份重復(fù)檢測(cè)。在確認(rèn)試驗(yàn)中，假設(shè)ODn值≤0.8時(shí)，該份樣品認(rèn)為是近期感染。BED檢測(cè)的流程見(jiàn)圖五。圖五 BED檢測(cè)流程圖9 數(shù)據(jù)分析9.1 HIV-1新發(fā)感染率的計(jì)算監(jiān)測(cè)哨點(diǎn) HIV-1新發(fā)感染率是指：各省哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)重點(diǎn)人群中，每年新感染HIV-1人群占暴露人群的比例。新發(fā)感染率的計(jì)算，原那么上以省為單位計(jì)算各重點(diǎn)人群新發(fā)感染率。當(dāng)樣品量足夠多時(shí)，也可以考慮按照地區(qū)計(jì)算新發(fā)感染率。也可以按照設(shè)定的因素對(duì)HIV-1新發(fā)感染率監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分層分析，如年齡、性別、感染途徑、婚姻狀況、行為因素、受教育程度等，可得到地區(qū)水平上的分層數(shù)據(jù)。將新發(fā)感染檢測(cè)數(shù)據(jù)匯總后〔參考附件4格式〕，即可進(jìn)行類(lèi)似分析。新發(fā)感染率有McDougal和Hargrove兩種計(jì)算法〔在中國(guó)推薦優(yōu)先使用McDougal計(jì)算法〕，每種方法均有中點(diǎn)公式和回憶公式。回憶公式是對(duì)在橫斷面抽樣前一年的新發(fā)感染率估計(jì)，中點(diǎn)公式是對(duì)在橫斷面抽樣約+/-6個(gè)月時(shí)的新發(fā)感染率估計(jì)?！?〕McDougal法〔調(diào)整靈敏度/特異度〕中點(diǎn)公式：回憶公式：校正因子F：〔2〕Hargrove法(調(diào)整特異度)中點(diǎn)公式：回憶公式：變量符號(hào)：①待計(jì)算的變量值：I＝新發(fā)感染率〔高危人群中每100人年新感染的數(shù)量〕，F(xiàn)＝調(diào)整靈敏度或特異度的調(diào)整因子；②在橫斷面調(diào)查中測(cè)量的變量值：T＝調(diào)查的總?cè)藬?shù)，P＝HIV-1檢測(cè)為陽(yáng)性的總?cè)藬?shù)，N＝HIV-1檢測(cè)為陰性的總?cè)藬?shù)，R＝BED檢測(cè)為新近感染的總?cè)藬?shù)；③從單獨(dú)的校準(zhǔn)研究中獲得的變量值：w＝窗口期〔從血清陽(yáng)轉(zhuǎn)到BED方法能夠判為新發(fā)感染的最長(zhǎng)時(shí)間〕，α＝BED檢測(cè)新發(fā)感染(＜1w)的靈敏度，β＝BED方法對(duì)感染時(shí)間在1w-2w天樣品的特異度，γ＝BED方法對(duì)感染時(shí)間超過(guò)2w天樣品的特異度，ε＝BED方法對(duì)感染時(shí)間超過(guò)2w天樣品的誤判率。我國(guó)BED方法HIV-1新發(fā)感染相關(guān)的校正系數(shù)值是基于分析來(lái)自1565個(gè)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)日期〔大約〕樣品的BED檢測(cè)值，這些值為：w=168天，α=0.8098，β=0.7571，γ=0.9315，ε=0.0685。9.2 HIV-1新發(fā)感染比例的計(jì)算 病例報(bào)告新發(fā)感染比例是指：〔以第二季度樣品為例〕各省每年第二季度新發(fā)現(xiàn)的感染者中，被BED識(shí)別為新近感染的感染者占所有進(jìn)行BED檢測(cè)的感染者的比例。病例報(bào)告新發(fā)感染比例=〔第二季度新發(fā)現(xiàn)的感染者中被BED判定為新近感染的感染者數(shù)/進(jìn)行BED檢測(cè)的第二季度新發(fā)現(xiàn)的感染者總數(shù)〕×100%。10結(jié)果反響中國(guó)CDC性艾中心新發(fā)感染檢測(cè)/監(jiān)測(cè)工作組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合流行病學(xué)資料和病史，進(jìn)行綜合分析、校正后，計(jì)算新發(fā)感染率，與各省分析討論后將最終數(shù)據(jù)反響各省/自治區(qū)/直轄市CDC，同時(shí)上報(bào)中國(guó)CDC和衛(wèi)生部。11質(zhì)量控制11.1 哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)質(zhì)量控制各省CDC指導(dǎo)各監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)按照“全國(guó)艾滋病監(jiān)測(cè)方案〞要求，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的抽樣、問(wèn)卷調(diào)查和采血進(jìn)行質(zhì)量控制。確保哨點(diǎn)將樣品和信息齊全的問(wèn)卷表同時(shí)送至艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。11.2 樣品質(zhì)控11.2.1 所有哨點(diǎn)樣品的采集、運(yùn)輸、檢測(cè)及保存必須嚴(yán)格按照“全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)〞執(zhí)行。11.2.2 所有哨點(diǎn)新報(bào)告的HIV陽(yáng)性樣品，保存在-20℃以下11.2.3 所有第二季度新報(bào)告的感染者樣品，統(tǒng)一保存在省確證中心實(shí)驗(yàn)室，11.3 試劑質(zhì)控11.3.1 BED試劑由性艾中心統(tǒng)一采購(gòu)，每批試劑有參比室進(jìn)行平行試驗(yàn)驗(yàn)證11.311.3.3 各實(shí)驗(yàn)室使用的檢測(cè)試劑必須按照要求保存〔分別放置在4℃11.311.311.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)控11.411.4.2 每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室必須建立SOP文件和QA/QC方案。11.411.4.4 每次試驗(yàn)必須通過(guò)試劑11.411.411.411.5 外部考核及檢查11.5.1 參加新發(fā)感染率檢測(cè)確實(shí)證中心實(shí)驗(yàn)室每年至少接受二次11.5.2 參加哨點(diǎn)樣品檢測(cè)的艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須通過(guò)11.5.3 國(guó)家參比室對(duì)確證中心實(shí)驗(yàn)室不定期進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)檢查，核對(duì)新發(fā)感染檢測(cè)11.5.4 確證中心實(shí)驗(yàn)室對(duì)哨點(diǎn)樣品的采集、保存、檢測(cè)及運(yùn)輸，不定期進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)及檢查，核對(duì)原始記錄，并將結(jié)果報(bào)至11.6 數(shù)據(jù)質(zhì)控11.6.1 各省需要填寫(xiě)的數(shù)據(jù)內(nèi)容，嚴(yán)格按照中國(guó)疾控性艾中心提供統(tǒng)一的HIV-1新發(fā)感染檢測(cè)樣品信息和結(jié)果報(bào)表〔附件1、2、311.6.2 各省須指定專(zhuān)人核對(duì)哨點(diǎn)陽(yáng)性樣品和病例報(bào)告陽(yáng)性樣品的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果及樣品背景信息〔哨點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)和病例報(bào)告數(shù)據(jù)庫(kù)〕，核對(duì)無(wú)誤并排除重復(fù)樣品11.6.3 全國(guó)新發(fā)感染檢測(cè)/監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的處理，由性艾中心國(guó)家參比室和流病室同時(shí)進(jìn)行核對(duì)，確保數(shù)據(jù)12數(shù)據(jù)使用和管理12.1 數(shù)據(jù)使用由哨點(diǎn)陽(yáng)性樣本獲得的新發(fā)感染檢測(cè)數(shù)據(jù)的使用權(quán)限，僅限于國(guó)家和省/自治區(qū)/直轄市CDC，可作為了解疫情和評(píng)估防治效果的參考依據(jù)。由病例報(bào)告系統(tǒng)陽(yáng)性樣本獲得的新發(fā)感染比例數(shù)據(jù)，不能用于估計(jì)疫情和評(píng)估防治效果，可考慮用于分析新發(fā)感染的主要人群來(lái)源、地區(qū)和年齡等分布。各省/市/自治區(qū)需綜合考慮BED檢測(cè)結(jié)果和其它流行信息。哨點(diǎn)新發(fā)感染檢測(cè)和病例報(bào)告新發(fā)感染比例的數(shù)據(jù)使用權(quán)限，僅限于國(guó)家和省/自治區(qū)/直轄市CDC，各省數(shù)據(jù)的使用權(quán)由各省疾控中心決定。結(jié)果不能反響到個(gè)體或其監(jiān)護(hù)人或其監(jiān)管場(chǎng)所，禁止將新發(fā)感染檢測(cè)數(shù)據(jù)用于個(gè)體診斷。12.2 數(shù)據(jù)管理新發(fā)感染監(jiān)測(cè)是在常規(guī)監(jiān)測(cè)根底上進(jìn)行的。只有在常規(guī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了新發(fā)感染者的樣品，才能夠進(jìn)行新發(fā)感染檢測(cè)。這些信息只能由監(jiān)測(cè)系統(tǒng)管理，不得泄露給任何個(gè)人和其他單位，資料應(yīng)保密。各省須制定保密SOP，確保新發(fā)感染監(jiān)測(cè)信息控制在監(jiān)測(cè)部門(mén)。參與相關(guān)工作的人員應(yīng)遵守平安性和保密性管理規(guī)定。13任務(wù)分工 中國(guó)CDC性艾中心承當(dāng)以下工作任務(wù)：〔1〕提供技術(shù)培訓(xùn)，指導(dǎo)編寫(xiě)SOP及質(zhì)控方案；〔2〕統(tǒng)一購(gòu)置BED試劑及質(zhì)控品；〔3〕組織實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證〔BED-PT〕；〔4〕對(duì)重點(diǎn)人群哨點(diǎn)陽(yáng)性樣品進(jìn)行BED檢測(cè)；〔5〕現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)、檢查，包括酶標(biāo)儀，洗板機(jī)，移液器狀況及其校準(zhǔn)情況；抽查哨點(diǎn)樣品的采集、保存及運(yùn)輸過(guò)程，抽查樣品庫(kù)，進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)核檢；〔6〕組織各省檢測(cè)結(jié)果及流行病學(xué)資料的匯總，分析；〔7〕方法學(xué)潛在偏倚的控制；〔8〕HIV-1新發(fā)感染率的計(jì)算與分析；〔9〕及時(shí)向各省反響數(shù)據(jù)。省CDC承當(dāng)以下工作任務(wù)：〔1〕收集哨點(diǎn)陽(yáng)性及病例報(bào)告陽(yáng)性樣品；〔2〕核對(duì)樣品背景信息，完成BED檢測(cè)；〔3〕收集、保存相關(guān)資料；〔4〕結(jié)合哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)，保證樣品質(zhì)量；〔5〕向中國(guó)CDC性艾中心提交有關(guān)結(jié)果〔哨點(diǎn)BED數(shù)據(jù)處理表、重點(diǎn)人群HIV-1新發(fā)感染率和附件二；病例報(bào)告BED數(shù)據(jù)處理表、HIV-1新發(fā)感染比例和附件三〕和樣品〔所有重點(diǎn)人群哨點(diǎn)陽(yáng)性樣品〕。參考文獻(xiàn)ADDINEN.REFLIST1. 沈圣,蔣巖.HIV新近感染檢測(cè)方法研究進(jìn)展.中華流行病學(xué)雜志2024,31:102-105.2. 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