基因工程 課件 2 DNA的生物合成

DNA的生物合成13.1DNA復(fù)制的概況

DNA復(fù)制是指親本DNA雙螺旋解開，兩條鏈分別作為模板，合成子代DNA分子的過程。

染色體外的遺傳物質(zhì)如質(zhì)粒和噬菌體，以及線粒體和葉綠體DNA也有基本相似的復(fù)制過程，但它們的復(fù)制受到染色體DNA復(fù)制的控制。

DNA復(fù)制過程的研究一般采用三類系統(tǒng)：

體外系統(tǒng)：ΦX174

DNA或質(zhì)粒DNA及其完成復(fù)制所必需的酶、蛋白質(zhì)及其因子構(gòu)成。

原核生物：以E.coli為模式生物。

真核生物：以酵母和動(dòng)物病毒為模式生物。半保留復(fù)制：DNA的兩條鏈彼此分開各自作為模板，按堿基配對(duì)規(guī)則合成互補(bǔ)鏈。由此產(chǎn)生的子代DNA的一條鏈來自親代，另一條鏈則是以這條親代鏈為模板合成的新鏈。13.1.1DNA的半保留復(fù)制13.1.2復(fù)制的起點(diǎn)和方向

基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱復(fù)制子，在每個(gè)細(xì)胞周期中，每個(gè)復(fù)制子只復(fù)制一次。原核細(xì)胞基因組、質(zhì)粒、許多噬菌體、某些病毒的DNA及真核生物的細(xì)胞器DNA一般由單個(gè)復(fù)制子構(gòu)成，從一個(gè)固定的起點(diǎn)開始復(fù)制。此時(shí)雙鏈DNA解開形成兩條單鏈，分別作為模板進(jìn)行復(fù)制，由此形成的結(jié)構(gòu)很像叉子，被形象地稱作復(fù)制叉。復(fù)制的方向大多是雙向的，并形成含有兩個(gè)復(fù)制叉的復(fù)制眼。少數(shù)是單向復(fù)制的，只形成一個(gè)復(fù)制叉。

1963年Cairns觀察在大腸桿菌DNA復(fù)制時(shí)所形成的放射自顯影圖片，結(jié)果低放射活性區(qū)在復(fù)制泡的中間，而高放射活性區(qū)在兩端，說明大腸桿菌染色體的復(fù)制是朝兩個(gè)方向進(jìn)行的。

環(huán)形DNA復(fù)制時(shí)，DNA會(huì)形成類似字母θ的形狀，故稱作θ型復(fù)制。

DNA復(fù)制的起始點(diǎn)是含有100～200個(gè)堿基對(duì)的一段DNA。

原核生物的環(huán)狀DNA只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，其復(fù)制叉移動(dòng)的速度約為105bp/min。E.coli的DNA復(fù)制一次需40min，在迅速生長的原核生物中，第一次復(fù)制尚未完成，第二次復(fù)制就在同一個(gè)始點(diǎn)上開始。

真核生物染色體的不同位置上有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制叉移動(dòng)較慢(5×102-5×103bp/min)，但由于復(fù)制叉數(shù)目很大，真核生物染色體DNA復(fù)制的總速度比原核生物更快。果蠅胚胎的基因組DNA總長為大腸桿菌的40倍，可在3min內(nèi)完成復(fù)制。

復(fù)制的起始（origin）

E.coli復(fù)制起點(diǎn)稱OriC由245bp組成，這一順序在細(xì)菌中高度保守，關(guān)鍵順序是3個(gè)13bp和4個(gè)9bp的重復(fù)序列。引發(fā)體由DnaB（解旋酶）DnaG（引物酶）和至少6種其它蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體，它可以將SSB置換下來，并按5'→3'方向合成約10～60nt的RNA引物。

①在HU蛋白、整合宿主因子（IHF）和ATP的參與下，DnaA四聚體結(jié)合于OriC的9bp重復(fù)順序。DNA則環(huán)繞其上形成類似核小體的結(jié)構(gòu)。

②DnaA水解ATP，驅(qū)動(dòng)13bp序列解鏈，形成約45bp的復(fù)制泡。

③

在DnaC、DnaT和ATP的參與下，2個(gè)DnaB蛋白被招募到復(fù)制叉。

④

在DnaB的作用下解鏈區(qū)擴(kuò)大，多個(gè)SSB結(jié)合于DNA的單鏈部分。同時(shí)，TOPII調(diào)整超螺旋。13.2.3DNA鏈的延伸

DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，但DNA合成的原料均為5'-核苷三磷酸，新鏈的合成方向是5'→3'。1968年岡崎等用3H標(biāo)記的脫氧胸苷短時(shí)間處理噬菌體感染的大腸桿菌，然后分離標(biāo)記的DNA，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)合成的是DNA小片段，接著很快出現(xiàn)較大的分子，這些DNA短片段被定名為岡崎片段。后來發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)请S復(fù)制叉連續(xù)合成的，稱前導(dǎo)鏈。另一條鏈?zhǔn)菑?fù)制叉分開一段距離后，按與復(fù)制叉移動(dòng)相反的方向，由5'→3'間斷合成的短片段連接而成的，稱為后隨鏈。這樣的復(fù)制過程稱作半不連續(xù)復(fù)制。

后來的研究發(fā)現(xiàn)，前導(dǎo)鏈和后隨鏈的DNA新鏈?zhǔn)怯赏粋€(gè)DNApolIII的兩個(gè)核心酶分別催化的。如何使后隨鏈合成位點(diǎn)靠近復(fù)制叉，且其延伸方向與復(fù)制叉的移動(dòng)方向一致呢？研究發(fā)現(xiàn)，后隨鏈的模板鏈環(huán)化，即可使這一問題得到解決。岡崎片段的RNA引物被DNApolI除去并用DNA鏈來替換，切口（nick）由DNA連接酶連接。RNA引物的合成和切除是一個(gè)高度耗能的過程，經(jīng)過漫長進(jìn)化生物體的為何會(huì)保留這種機(jī)制？一種可能的解釋是，DNA復(fù)制時(shí)，最初合成的幾個(gè)核苷酸對(duì)還沒有形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，其堿基堆積力和氫鍵結(jié)合力弱，DNA聚合酶不容易進(jìn)行3'→5'的校對(duì)，因此發(fā)生錯(cuò)誤的幾率大。采用RNA引物作為過渡形式，進(jìn)行切口平移時(shí)，用DNA鏈替代RNA引物時(shí)，由于前一個(gè)岡崎片段足夠長，且DNApol?具有3'→5'校對(duì)功能，所以發(fā)生錯(cuò)誤的幾率很小。雙向復(fù)制的環(huán)形DNA，兩個(gè)復(fù)制叉合成新鏈的速度一旦出現(xiàn)差異，就可能為復(fù)制的終止造成麻煩。研究發(fā)現(xiàn)，E.coli的順時(shí)針復(fù)制叉有4個(gè)連續(xù)排列的終止子，逆時(shí)針復(fù)制叉有3個(gè)連續(xù)排列的終止子，當(dāng)一個(gè)復(fù)制叉先期到達(dá)終止區(qū)時(shí)，被稱作終點(diǎn)利用物質(zhì)（Tus）的蛋白質(zhì)與ter結(jié)合而阻止復(fù)制，待另一個(gè)復(fù)制叉到達(dá)同一位置，才可完成整個(gè)DNA的復(fù)制過程。

13.2.4復(fù)制的終止單向復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，其復(fù)制的終點(diǎn)就是其原點(diǎn)。13.3.3真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)（1）真核細(xì)胞與原核細(xì)胞DNA復(fù)制的共同點(diǎn)：①為半保留復(fù)制。②為半不連續(xù)復(fù)制。③需要解旋酶解開雙螺旋，并由SSB同單鏈區(qū)結(jié)合。④需要拓?fù)洚悩?gòu)酶消除解螺旋形成的扭曲張力。⑤需要RNA引物。⑥新鏈合成均有校對(duì)機(jī)制。（2）真核細(xì)胞與原核細(xì)胞DNA復(fù)制的差別：①原核生物的復(fù)制子

>真核生物的復(fù)制子。②復(fù)制叉移動(dòng)的速度：原核生物（900nt/S）>真核生物（50nt/S）。③岡崎片段的大?。涸松铮?000～2000nt）>真核生物（100～200nt）。

④真核細(xì)胞的DNA聚合酶和蛋白質(zhì)因子的種類比原核細(xì)胞多，引發(fā)酶活性由DNApolα