2024屆高三二輪復習生物：PCR技術1-重疊PCR技術

科普課：重疊PCR技術致敬：凱利·穆利斯凱利·穆利斯（KaryBanksMullis，1944年12月-2019年8月7日），美國著名化學家，因發(fā)明高效復制DNA片段的“聚合酶鏈式反應（PCR）”方法而獲得1993年諾貝爾化學獎。一.PCR技術PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴增增強因子，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。DNA聚合酶：

①具有5’→3’聚合酶活性，這就決定了DNA只能沿著5’→3’方向合成；

②需要引物，DNA聚合酶不能催化DNA新鏈從頭合成，只能催化dNTP加入核苷酸鏈的3'-OH末端。因而復制之初需要一段DNA引物的3’一OH端為起點，合成5’→3’方向的新鏈。DNA5’5’3’3’5’引物A5’引物B二.重疊PCR技術1.重疊PCR技術的定義重疊延伸PCR技術(genesplicingbyoverlapextensionPCR，SOEPCR)，是采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術。這項技術目前主要有兩個應用方向：構建融合基因；基因定點突變。引物A引物B設計：不同基因的引物互補序列二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因?qū)⒒騇和基因N鏈接起來的方法，我們可以用同尾酶切割，再用DNA鏈接酶將他們連在一起。但有時我們并不一定能夠找到合適的酶切位點，或者說我們找到了酶切位點，但這種酶的特殊性（價格，保存），因此使用限制酶和DNA連接酶很難得到產(chǎn)物。基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因重疊PCR技術可以將基因M和基因N鏈接起來。其過程為：基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N設計引物PCR擴增兩端回收兩端片段兩端片段退火延伸擴增全長基因二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N引物B引物A引物C引物D①設計引物D’與引物D互補配對A’與引物A互補配對D’A’二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N引物B引物A引物C引物D②PCR擴增兩端D’與引物D互補配對A’與引物A互補配對D’A’PCR只擴增兩個引物之間的DNA片段，因此我們只分析其構建的兩個引物（D’-A引物，A’-D引物）的與之結(jié)合的DNA鏈的復制。因為設計的這兩個因為堿基互補配對，所以基因M,基因N要單獨進行PCR擴增。二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N引物B引物A引物C引物D②PCR擴增兩端D’與引物D互補配對A’與引物A互補配對D’A’5’3’AD’5’3’DA’PCR擴增第一次二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因②PCR擴增兩端D’與引物D互補配對A’與引物A互補配對5’3’AD’5’3’DA’PCR擴增第二次5’3’AD’5’3’DA’5’3’5’3’5’3’引物BA’D5’3’引物C二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因③回收兩端片段

并進行④兩端片段退火延伸5’3’AD’5’3’DA’5’3’引物BA’D5’3’引物C為了方便理解，我們把這4條鏈編上序號：1、2、3、4，退火后的結(jié)果為：AD’15’3’12345’3’4DA’AD’引物CAD’35’3’5’引物BA’2D3’基因M和基因N重疊區(qū)域二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因⑤擴增全長基因DA’AD’15’3’5’3’4引物CAD’35’3’5’引物BA’2D3’DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，這就決定了DNA只能沿著5’→3’方向合成；（

）（

）√×二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（1）構建融合基因⑤擴增全長基因3引物CAD’5’3’5’引物BA’2D3’DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，這就決定了DNA只能沿著5’→3’方向合成；（

）√DNA聚合酶會結(jié)合在該DAN分子上，繼續(xù)完成該DNA的合成，進而將基因M,基因N鏈接在一起DNA聚合酶DNA聚合酶二.重疊PCR技術2.重疊PCR技術的應用（2）定點突變設計四種引物，用第一對引物（a、b）擴增含有突變位點及其上游序列的DNA片段，第二對引物（c、d）被用來擴增含突變位點及其下游序列的DNA片段，兩個側(cè)翼引物（a、d）含野生型序列，兩個突變引物（b、c）含有希望引進的突變位點，如置換、插入或缺失的堿基（紅點）?；旌蟽纱蜳CR的產(chǎn)物，由于兩個突變引物有重疊區(qū)，重疊片段之間退火、延伸成異源雙鏈，加入外側(cè)引物進行第三次PCR，即可得到目標突變體。突變引物b和突變引物c堿基互補配對并含有用于替換、插入或缺失的堿基5’5’3’3’上游引物a下游引物d突變引物c突變引物b(獨立體系1)PCRcadb(獨立體系2)PCR5’3’5’3’重疊、延伸a5’3’d5’3’3’5’3’5’PCR二.重疊PCR技術例1.（北京?海淀?期中）蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對人體沒有影響。我國科學家欲獲得高效表達蛋白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，做了相關研究。（1）研究者用相同的

酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到了重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒置于經(jīng)

處理的大腸桿菌細胞懸浮液中，獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。（2）檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌中表達效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好。因而設計了與蛋白A基因結(jié)合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基），并按圖2方式依次進行4次PCR擴增，以獲得新的蛋白A基因。限制酶和DNA鏈接酶氯化鈣引物A引物B引物C引物DPCR1PCR2PCR3PCR4二.重疊PCR技術①這是一種定點

技術。②圖2所示的4次PCR應該分別如何選擇圖1中所示的引物？請?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若選用該引物劃“×”）基因突變√√××××√√××××√××√二.重疊PCR技術（3）研究者進一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和

分別導入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用

方法檢測并比較三組受體菌蛋白A的表達產(chǎn)物，判斷蛋白A基因表達效率是否提高。為檢測表達產(chǎn)物的生物活性。研究者將上述各組表達產(chǎn)物加入到長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，比較

大小，以確定表達產(chǎn)物的生物活性大小。（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，其優(yōu)點是

。含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒空質(zhì)粒（pET質(zhì)粒）、抗原