酵母雙雜交中的蛋白-蛋白相互作用

酵母雙雜交中的蛋白-蛋白相互作用

1共表型的制備雙混合的原則上是基于對許多真核生物的控制過程的理解。初始點特殊轉(zhuǎn)移激活因素通常有兩個相互關聯(lián)的結(jié)構(gòu)區(qū)，即特定字段結(jié)構(gòu)區(qū)（cd）和異常字段結(jié)構(gòu)區(qū)（ad）。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能,互不影響,但一個完整的激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域,否則無法完成激活功能。所以可以將兩種蛋白(可以是已知,也可以是未知的)與上面兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白。將編碼已知蛋白質(zhì)(常稱為誘餌蛋白質(zhì),baitprotein)的基因與編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列融合,在酵母中表達產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)稱為BD-Bait;編碼未知蛋白(常稱為捕獲蛋白質(zhì),preyprotein)的基因與編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的序列融合,并在酵母中表達產(chǎn)生另一融合蛋白稱為AD-Prey。把這兩種融合蛋白共表達于宿主細胞中,如果這兩個待測蛋白間能發(fā)生相互作用,就會通過待測蛋白的橋梁作用,使AD與BD形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子,并激活相應的報告基因表達。通過對報告基因表型的測定,可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。反之,如果待測蛋白間不發(fā)生相互作用,則BD和AD不能結(jié)合,報告基因的轉(zhuǎn)錄不能被激活。如果將Prey換成基因文庫,即可直接從基因文庫中篩選到能與Bait相互作用蛋白的DNA序列。2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的應用2.1雙雜交互作用的靈敏度利用雙雜交系統(tǒng)可用來檢測兩個蛋白之間是否存在相互作用,只需將編碼兩個蛋白的DNA序列分別克隆至雙雜交系統(tǒng)的載體中,即可通過檢測報告基因是否表達,從而論證這兩個蛋白是否發(fā)生了交互作用。用傳統(tǒng)的蛋白檢測方法也能驗證這種交互作用的發(fā)生,但雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點在于它的高靈敏度,而且反映了蛋白在體內(nèi)的交互作用。如在Aelst等所做的實驗中,用雙雜交系統(tǒng)能檢測出免疫沉淀法無法檢測到的Ras-Raf的交互作用,表明雙雜交系統(tǒng)具有非常高的靈敏性,能檢測出蛋白間微弱的相互作用,這是因為:(1)雜合蛋白一般是由高拷貝質(zhì)粒的強啟動子過量表達的蛋白;(2)雙雜交系統(tǒng)能檢測出瞬間發(fā)生的信號反應,而一般的體外檢測法蛋白則要經(jīng)過一系列洗滌過程,往往導致交互作用不再發(fā)生;(3)融合蛋白的交互作用由于BD和DNA序列的相互結(jié)合變得更為穩(wěn)定;(4)在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生了一些復合酶使信號放大。在證實兩個蛋白形成交互作用后,可以對該蛋白進行缺失實驗,通過缺失掉不同的片段來驗證該蛋白在雙雜交系統(tǒng)中是否仍具有激活轉(zhuǎn)錄的功能,從而對蛋白質(zhì)中起作用的功能進行精確的定位,進而可以在相互作用的最小區(qū)域內(nèi)進行DNA點突變,改變氨基酸序列,再測定突變體是否仍能激活報告基因的表達,從而找到交互作用發(fā)生所必需的氨基酸殘基。這是雙雜交系統(tǒng)的特點所決定的,因為它是在DNA水平上表達蛋白質(zhì),只要缺失掉相應的DNA片段即可達到我們的目的,而傳統(tǒng)的檢測方法則無能為力。另外,通過該方法還能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,例如Li等在p53和SV40大T抗原的結(jié)合實驗中,對p53進行突變試驗,發(fā)現(xiàn)突變型的p53失去了和T抗原結(jié)合的能力,這與一些癌癥患者的p53蛋白發(fā)生的突變是一致的。2.3模式1:雙雜交蛋白系統(tǒng)這是雙雜交系統(tǒng)最廣泛、最有價值的應用。將感興趣的目標蛋白基因克隆至BD載體,而將要篩選的cDNA庫克隆在AD載體,共同轉(zhuǎn)化酵母宿主菌,如cDNA序列編碼的某一段蛋白能和靶蛋白發(fā)生交互作用,則啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄,據(jù)此可以找到一個新的結(jié)合蛋白,使用雙雜交系統(tǒng)篩選到的新蛋白已經(jīng)相當多,并仍在繼續(xù)擴大,這些蛋白在信號傳導方面很可能扮演了重要角色。例如,由于PKC在細胞的發(fā)育和分化中所起的中心作用,Staudinger等將PKC的催化部分克隆到GAL4的BD作為“誘餌”來篩選小鼠T細胞的cDNA庫,果然找到了一個新的蛋白PICK1,它和PKC的催化結(jié)構(gòu)域?qū)Ｒ恍缘匕l(fā)生交互作用,并用是PKC磷酸化作用的底物,對PICK1進行深入的研究將會使我們再清楚地了解和PKC有關的信號傳導途徑。2.4小分子多充皮膚用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與某種藥物設計目標的蛋白分子相互作用的多膚,則篩選到的分子中可能會含有一些具有藥物治療作用的小分子多膚。Yang等證明了一段Leu-X-Cys-X-Glu肽可以與成視網(wǎng)膜母細胞瘤(Rb)蛋白相互作用,為這項工作打下基礎。2.5其他蛋白活性的檢測確定兩個蛋白質(zhì)A、B具有相互作用以后,在恢復轉(zhuǎn)錄活性的雙雜交系統(tǒng)中加入第三種物質(zhì)C,再定量檢測報告基因的表達強度,可以確定C對A、B之間相互作用的抑制或增強。Dixx通過APP蛋白重建了Ga14的轉(zhuǎn)錄活性,然后加入蛋白酶檢測它是否可以切斷蛋白,從而阻斷Gal4的轉(zhuǎn)錄。若此蛋白酶的作用被證實,則還可加入第4種物質(zhì),來篩選蛋白酶的抑制劑。2.6蛋白質(zhì)-相互作用圖譜的建立隨著基因組及后基因組計劃的研究與發(fā)展,及各種mRNA在不同組織器官與生長發(fā)育不同階段的分布(時空分布)圖譜的構(gòu)建,蛋白質(zhì)相互作用圖譜的繪制業(yè)已展開。在雙雜交的AD與BD質(zhì)粒中同時連入cDNA文庫,進行庫-庫篩選,結(jié)合基因微點陣與生物信息學技術,則可以繪制出網(wǎng)狀的蛋白聯(lián)系圖譜。2.7tnf2r家族在細胞毒性檢測方面的應用蛋白質(zhì)間或蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用是細胞信號轉(zhuǎn)導中重要的信號傳遞形式。Kiston等利用雙雜交系統(tǒng)研究了TNF2R家族的細胞表面受體,發(fā)現(xiàn)它們存在一個由70~80個氨基酸構(gòu)成的保守域,它是引發(fā)細胞凋亡(apoptosis)的“死亡區(qū)域”,并同時發(fā)現(xiàn)了一個新的具有“死亡區(qū)域”的TNF2R家族的表面受體WSL21蛋白(DR3/APO23)。Dortay等利用大規(guī)模酵母雙雜交技術檢測出了擬南芥細胞分裂素信號途徑中的大多數(shù)蛋白質(zhì)成員間的42種新的相互作用,證明該途徑中蛋白質(zhì)家族之間存在明顯的相互作用,而同一家族的蛋白質(zhì)之間卻很少發(fā)生相互作用;同時發(fā)現(xiàn)相互作用的網(wǎng)絡中心是磷酸轉(zhuǎn)運蛋白,它與所有其他蛋白質(zhì)家族的成員都發(fā)生相互作用。3“vitro”與酵母雙雜交系統(tǒng)的比較傳統(tǒng)的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法如交聯(lián)、免疫共沉淀、親和層析等均是采用體外實驗(invitro)進行的,它受到環(huán)境、實驗條件等多種因素的影響。而酵母雙雜交系統(tǒng)則是采用體內(nèi)實驗(invivo),不易受外界環(huán)境的影響,而且所有操作均在核酸水平上進行,不需要蛋白質(zhì)的大量純化就可以檢測到蛋白間微弱的相互作用。但是該系統(tǒng)也存在一定的局限性。3.1重視細菌雙雜交分析過程中的假陽性現(xiàn)象由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母內(nèi)表達時的轉(zhuǎn)錄激活作用,使prey-BD融合基因與bait-AD融合基因表達產(chǎn)物無需特異結(jié)合就能啟動轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)?；蛘吣承┑鞍椎谋砻嬗袑ζ渌鞍椎牡陀H和力區(qū),易形成蛋白體復合物,也可引起報告基因的表達,使酵母出現(xiàn)相應表型,產(chǎn)生假陽性結(jié)果。所分析的可能存在相互作用的蛋白必須定位于核內(nèi),才能激活報告基因,但很多蛋白的相互作用依賴于翻譯后加工,如二硫鍵的形成等要在胞漿內(nèi)完成。因此有些蛋白就不能采用該方法。假陰性現(xiàn)象也是雙雜交分析過程中經(jīng)常碰到的問題。為此人們初步建立了哺乳動物雙雜交系統(tǒng)作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段。另外還構(gòu)建了SOS恢復系統(tǒng)和泛素專一性蛋白酶系統(tǒng)針對膜受體,細胞外分泌蛋白等方面進行研究。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能(如RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄激活因子)或在酵母中表達時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域,能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復合物,從而引起報告基因的表達,產(chǎn)生“假陽性”的結(jié)果。為了解決這個問題,Marsolier等人提出了建立在RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄基礎上的雙雜交系統(tǒng)。James等人還構(gòu)建了含三種不同的報告基因(ADE2,HIS3和LacZ)的酵母PJ69-4A菌株,這三種報告基因分別受三種不同的啟動子(Gall,Ga12和Ga17)調(diào)控,而這三種不同的啟動子都由GAL4激活,該菌株可靈敏地檢測出很弱的結(jié)合作用,從而顯著地消除假陽性。3.3酵母細胞的生長某些誘餌蛋白質(zhì)或待篩選蛋白質(zhì)在酵母中大量表達時,可能對酵母產(chǎn)生一定的毒性作用,如使酵母體內(nèi)的信號傳導通路阻斷,干擾酵母中正常基因的表達調(diào)控,抑制酵母細胞的分裂,甚至使酵母細胞在選擇性培養(yǎng)基上不能生長等,由此使得某些種類的蛋白質(zhì)不能在該系統(tǒng)中進行分析。針對這些異源蛋白質(zhì)對酵母生長的毒性作用,近年來在雙雜交系統(tǒng)中的主要改進是選用更加靈敏的報告基因從而降低這些異源蛋白在酵母中的表達量,減輕這些異源蛋白質(zhì)在酵母中的毒性,如采用LexA酵母雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)中GAL4的BD區(qū)段被原核生物的LexA蛋白質(zhì)編碼區(qū)所取代,單純疤疹病毒的88個VP編碼區(qū)則取代了GAL4的AD區(qū)段。4靈敏度和特異性由于酵母雙雜交系統(tǒng)仍存在著一定的缺陷與局限,基于酵母雙雜交的基本原理,近年來,雙雜交系統(tǒng)在被廣泛應用中不斷得到改進,產(chǎn)生了許多相關的研究方法與技術,其靈敏度和特異性也得到了顯著提高。4.1酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)(One-hybridsystem)最早是1993年由Li根據(jù)酵母雙雜交技術的原理提出的,用于研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用。單雜交系統(tǒng)與雙雜交系統(tǒng)的區(qū)別在于前者把要研究的DNA序列置于報告基因上游,以這段特異性的DNA序列為誘餌,去篩選cDNA文庫編碼的靶蛋白,不需要BD-X的參與;而雙雜交系統(tǒng)是用誘餌蛋白來篩選與之結(jié)合的蛋白。單雜交系統(tǒng)在細胞信號轉(zhuǎn)導以及基因調(diào)控等功能研究中有重要作用。4.2逆向報告基因反向雙雜交系統(tǒng)(Reversetwo-hybridsystem)最早是在1996年由Vidal等提出的。該系統(tǒng)采取反向篩選的方法,最大的特點就是將蛋白質(zhì)之間的解離作用變?yōu)橐环N選擇優(yōu)勢,其關鍵在于逆向報告基因的引入。常用的報告基因有3種,即URA3、CYH2和LYS2。當野生型BD2X與AD2Y間發(fā)生相互作用時,啟動了毒性報告基因的表達,它對酵母菌株有毒性或者是致死的。當二者解離時毒性報告基因不能表達,菌株具有生長優(yōu)勢。在對蛋白質(zhì)中有重要作用的功能域、作用位點以及影響蛋白質(zhì)結(jié)合或解離因素的研究中,反向雙雜交系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。4.3對系統(tǒng)的影響核外雙雜交系統(tǒng)是構(gòu)建在一個非轉(zhuǎn)錄基礎上的雙雜交系統(tǒng),也叫SOS蛋白招募系統(tǒng)(SOSrecruitmentsystem)。它是把蛋白質(zhì)相互作用的場所從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到酵母的細胞膜上,通過應用兩個蛋白質(zhì)相互作用后對Ras信號通路的恢復作用而取代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活機制,克服了傳統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)的一些局限性。SOS蛋白招募系統(tǒng)的主要優(yōu)點在于被研究蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)生在細胞質(zhì)而不是細胞核中,因此,其應用范圍更加廣泛,但同時也存在一些假陽性問題。4.4第3個分子融合系統(tǒng)三雜交系統(tǒng)(Three-hybridsystem)是Sen-Gupta于1996年發(fā)展起來的,其基本原理與雙雜交系統(tǒng)基本相同,只是2個蛋白的相互作用需通過第3個分子的介導。這一系統(tǒng)的主要特征是兩個融合蛋白在空間上的靠近需要第3個分子的參與,第3分子可以是蛋白質(zhì)、激酶、多肽、DNA、RNA或小分子配體等。它們可通過修飾誘餌蛋白或靶蛋白使二者發(fā)生相互作用,或者誘導它們的構(gòu)象發(fā)生改變從而產(chǎn)生相互作用,進而啟動報告基因的表達。4.5蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)—哺乳動物雙雜交系統(tǒng)哺乳動物雙雜交系統(tǒng)能夠檢測相互作用依賴于需經(jīng)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。酵母菌屬于低等的真核生物,對蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾如糖基化、甲基化、磷酸化以及二硫鍵的形成等修飾水平很低。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)可克服酵母雙雜交系統(tǒng)的不足,適用于對蛋白質(zhì)功能的進一步研究,其原理和酵母雙雜交系統(tǒng)相同,把編碼誘餌蛋白和靶蛋白的基因克隆到相應的載體上,采用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)入Hela等哺乳動物細胞中,當餌蛋白和靶蛋白發(fā)生相互作用時,激活了報告基因,可通過報告基因的表達產(chǎn)物進行檢測。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)已成功地驗證了小鼠P53蛋白與SV40大T抗原之間以及FRAP與FKBP12兩種蛋白之間的相互作