四逆湯烏頭類生物堿的電噴霧質(zhì)譜研究

四逆湯烏頭類生物堿的電噴霧質(zhì)譜研究

對中藥復(fù)方中化學(xué)成分的分析越來越受到重視，但對烹飪過程中化學(xué)成分的變化和原因的研究很少。復(fù)方中化學(xué)成分的含量主要由其是否容易溶出和溶出后是否發(fā)生化學(xué)反應(yīng)兩種因素決定。溶出率受煎煮時間、火候、煎煮次數(shù)、溫度和溶劑用量等因素影響,并建立了溶出率與以上因素之間的數(shù)學(xué)模型。復(fù)方中的化學(xué)反應(yīng)包括水解、絡(luò)合和氧化等,但將溶出和水解同時考慮的研究不多。四逆湯由制附子、炙甘草、干姜3味中藥組成,是中醫(yī)臨床的經(jīng)典方劑,烏頭生物堿是其中主要活性成分。電噴霧質(zhì)譜技術(shù)在藥物分析中被廣泛應(yīng)用。本實驗以四逆湯為體系,采用電噴霧質(zhì)譜技術(shù)研究了溶出和水解這兩種因素對復(fù)方中烏頭生物堿的影響。1實驗部分1.1形態(tài)2:劍氣流速氮?dú)饬魉倜绹鳩innignLCQ電噴霧質(zhì)譜儀。儀器條件:毛細(xì)管溫度:180℃;噴霧電壓:5kV;鞘氣(氮?dú)?流速:60L/h;毛細(xì)管電壓:38V;注射泵流速:3μL/min。制附子、炙甘草和干姜購于長春市藥店,烏頭堿(0720-9807)、中烏頭堿(799-9403)和次烏頭堿(798-9403)對照品購于中國藥品生物制品檢定所,其他試劑均為分析純。1.2提取氨基酸、提取工藝1.2.1用附子中的堿性提取取5g制附子,100mL無水乙醇浸泡48h,提取液用甲醇稀釋5倍后,得0.01g生藥/mL溶液,電噴霧質(zhì)譜儀檢測。1.2.2多糖等說的分離取6g制附子、6g炙甘草和4g干姜,200mL蒸餾水煎煮3次,每次40min,濃縮至45mL。向煎煮液中加入180mL無水乙醇,靜置,24h后抽濾分離多糖等大分子,溶液減壓蒸干后用50mL蒸餾水溶解,氨水調(diào)至pH=10,氯仿萃取(30mL×3)后合并。氯仿溶液用甲醇稀釋5倍后電噴霧質(zhì)譜儀檢測。1.2.3殘留氧化物提取液的制備將上述四逆湯中的制附子從藥渣中挑出,蒸餾水洗凈后用10mL無水乙醇浸泡48h,得殘留生物堿的乙醇提取液,該溶液用甲醇稀釋5倍后電噴霧質(zhì)譜儀檢測。1.2.4水質(zhì)噴霧檢測稱取1.16mg烏頭堿、0.92mg中烏頭堿和0.89mg次烏頭堿,氯仿定容于50mL容量瓶中,該溶液以甲醇稀釋10倍后用電噴霧質(zhì)譜儀檢測;取5mL混合生物堿氯仿溶液,用5mL蒸餾水萃取3次,取水層以甲醇稀釋3倍,用電噴霧質(zhì)譜儀檢測;另取5mL混合生物堿氯仿溶液,減壓蒸干后用100mL蒸餾水溶解,加熱15min后,用甲醇稀釋2倍,采用電噴霧質(zhì)譜儀檢測。2脂堿衍生物所生成的化合物附子中的烏頭生物堿包括雙酯型二萜生物堿(diester-diterpenoidalkaloids,DDA)和脂類生物堿(脂堿,lipo-alkaloids)。DDA包括烏頭堿(aconitine,AC)、中烏頭堿(mesaconitine,MA)和次烏頭堿(hypaconitine,HA)等。脂堿是DDA的C8位上乙?；蛔貦磅；?、亞油?；蛴王；戎觉；〈纬傻难苌?。GC-MS技術(shù)證明DDA煎煮后水解為單酯型生物堿(monoester-diterpenoidalkaloids,MDA),但附子中脂堿在復(fù)方中變化規(guī)律的研究以及DDA結(jié)構(gòu)的差異對水解反應(yīng)的影響未見報道。我們通過分析和比較制附子、復(fù)方和煎煮后的制附子中生物堿的相對含量試回答以上問題,并利用3種對照品驗證生物堿的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系。2.1m/z工藝流程見圖1。由圖1所見,在制附子乙醇提取液的電噴霧質(zhì)譜圖中觀察到以下質(zhì)子化的生物堿分子:苯甲酰次烏頭原堿(benzoylhypaconine,BH,m/z574)、苯甲酰中烏頭原堿(benzoylmesaconine,BM,m/z590)、苯甲酰烏頭原堿(benzoylaconine,BA,m/z604)、HA(m/z616)、去氧烏頭堿(DA,m/z630)、AC(m/z646)、8-棕櫚酰-苯甲酰次烏頭原堿(HAP,m/z812)、8-亞油酰-苯甲酰次烏頭原堿(HAL,m/z836)、8-亞油酰-苯甲酰中烏頭原堿(MAL,m/z852)和8-亞油酰-苯甲酰烏頭原堿(ACL,m/z866)。m/z770離子的歸屬尚未確定。這些生物堿結(jié)構(gòu)相似,所以電離效率相近,其質(zhì)譜峰的相對豐度可以近似地反映它們的相對含量。[HA+H]+(m/z616)是基峰,說明HA是制附子中主要的雙酯型生物堿,這也與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析結(jié)果一致。2.2脂堿和雙酯型衍生物見圖2。由圖2可見,四逆湯中的二萜生物堿可以分為3類,即MDA(m/z500~600),DDA(m/z600~700)和脂堿(m/z800~900)。MDA在四逆湯中含量較高,[BH+H]+(m/z590)是基峰;雙酯型生物堿的含量次之,[HA+H]+的豐度為25%,并且沒有觀察到DA和AC。值得注意的是,在四逆湯中發(fā)現(xiàn)了少量的脂類生物堿(豐度<10%),部分該類生物堿在人參四逆湯中雖有報道,但未分得純品。2.3制備成堿的測定在四逆湯中的脂堿的相對含量低于附子,一種可能是脂堿因為其長鏈脂肪?；拇嬖诙y溶于水。為驗證該假設(shè),將與炙甘草和干姜共煎后的制附子挑出后提取其中的生物堿。由圖3可見,脂堿的含量最高,MDA次之,未檢測出HA。這些結(jié)果說明在煎煮過程中脂堿成為煎煮后附子中的主要生物堿,在煎煮過程中不易溶出,而大部分的HA已溶出。不難看出生物堿二萜骨架上C8位取代基是長鏈脂肪?；蛞阴；?顯著影響水溶性,復(fù)方中HA的含量低于制附子中相應(yīng)的生物堿的原因在于水解,脂堿的含量低則由溶出平衡所決定。2.4在不同的水溶液中分離出兩種分子離子峰,其比對其文化成分的影響如據(jù)報道生附子所含的DDA中MA和AC的含量較高,而在制附子和含有制附子的中成藥中,HA含量較高。本實驗在制附子中也主要檢測到HA。為說明這種現(xiàn)象是具有必然性還是可能存在樣品差異,為制附子的質(zhì)量控制提供依據(jù),下面從水溶性和水解性兩個方面進(jìn)行分析。因為在煎煮過程中,附子中DDA溶出的同時還伴隨水解反應(yīng),比較它們的水溶性較困難,所以通過比較HA與MA和AC在氯仿層的分子離子峰豐度(圖4)和它們在水萃取層的分子離子峰豐度(圖5)考察它們的水溶性差異。在圖4中,[AC+H]+∶[MA+H]+∶[HA+H]+的豐度比是100∶70∶67,而它們的物質(zhì)的量比是100∶79∶77,這表明對于生物堿來說,可以用分子離子峰的豐度定性地反映出它們的相對含量。由圖5可見,[AC+H]+∶[MA+H]+∶[HA+H]+的豐度比變?yōu)?00∶80∶90,[AC+H]+仍為基峰,但MA和HA的含量有所增加,特別是HA含量增加較多,說明HA比MA和AC更易溶于水,水溶性差異不是制附子中HA含量較高的原因。2.5[ac+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ma+h]+[h]+[ma+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+h]+[ha+h]+[ma+為比較3種對照品在水中的穩(wěn)定性,將生物堿的氯仿溶液減壓蒸干后用蒸餾水溶解,加熱15min后進(jìn)行ESI-MS分析(圖6)。加熱后,烏頭堿和中烏頭堿顯著減少,[AC+H]+∶[MA+H]+∶[HA+H]+的豐度比變?yōu)?5∶35∶100,即基峰由加熱前的[AC+H]+變?yōu)閇HA+H]+?？梢?HA比AC和MA具有更高的熱穩(wěn)定性,由于HA的C3位是-H,而AC和MA的C3位是-OH,說明結(jié)構(gòu)上的差異對它們的化學(xué)穩(wěn)定性影響較大,進(jìn)而影響平衡移動和它們在藥材組織中的剩余量,HA成為制附子中主要的DDA,具有化學(xué)上的必然性。3dda和雙酯型生物和脂堿溶出過程平衡方程傳統(tǒng)的植化分離方法已從含有附子的復(fù)方中分離出苯甲酰中烏頭堿和烏頭堿,但對其他單酯和雙酯型生物堿報道較少,并且該方法從烏頭屬植物中難以得到脂類生物堿的純品,從水煎液中分離出脂堿的難度更大。由于脂堿結(jié)構(gòu)非常相近,在液相色譜上也較難分開,因此,電噴霧質(zhì)譜是較合適的分析四逆湯中烏頭類生物堿的方法,各質(zhì)子化分子離子峰的歸屬可通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)一步證明(文中未給出)。由于同時檢測生物堿,分子離子峰的豐度可以半定量地反映出生物堿含量的變化。為討論方便,可以近似認(rèn)為煎煮過程中只發(fā)生MDA的溶出、脂堿的溶出和DDA的溶出及水解反應(yīng)3種情況,下面以DDA為例列出平衡方程。t=0t=tMDA0a?K2?Κ2DDA0b(solution)?K1(solution)?Κ1DDAC0c(material)c=C0?a?bK2=baK1=C0?a?bbK1K2=C0?a?K2aaa=C0K2+K1K2+1=1K2(1+K1)+1C0(1)c=C0-a-bΚ2=baΚ1=C0-a-bbΚ1Κ2=C0-a-Κ2aaa=C0Κ2+Κ1Κ2+1=1Κ2(1+Κ1)+1C0(1)b=K2K2(1+K1)+1C0(2)b=Κ2Κ2(1+Κ1)+1C0(2)c=K1K2K2(1+K1)+1C0(3)c=Κ1Κ2Κ2(1+Κ1)+1C0(3)上式中設(shè)C0為DDA的初始濃度,即附子中的DDA全部溶解且不發(fā)生水解反應(yīng)的理論濃度,未加熱時,t=0;加熱t(yī)時間后,煎煮液中苯甲酰單酯型生物堿、雙酯型生物堿和藥材組織中未煎出的雙酯型生物堿濃度分別為a,b和c。固定投藥量和最后的煎煮體積,則C0為定值。如果已知雙酯型烏頭堿的溶出平衡常數(shù)K1和水解平衡常數(shù)K2,則可推導(dǎo)出t時刻a,b和c的值。調(diào)整K1、K2的值,還可以用以上平衡表示單酯型生物堿和脂堿的溶出過程。但因為復(fù)方體系和煎煮過程非常復(fù)雜,即使單一生物堿的K1和K2的精確值也很難確定,對每種組分都確定出其K1和K2難度更大。但可以根據(jù)組分是否易溶出和是否穩(wěn)定