四逆散的藥對(duì)配伍作用及機(jī)制研究

四逆散的藥對(duì)配伍作用及機(jī)制研究

1中藥成分的活性評(píng)價(jià)研究尚需要深入評(píng)價(jià)中藥方劑是中醫(yī)辨證論治、理法方劑的重要手段之一。多年來(lái)，它的獨(dú)特規(guī)律和療效得到了臨床實(shí)踐的證實(shí)。多年來(lái)的研究已在一定程度上闡明了許多方劑作用的機(jī)理和物質(zhì)基礎(chǔ),這些物質(zhì)基礎(chǔ)包括黃酮類、皂苷類、生物堿類、萜類、內(nèi)酯類等成分,不僅賦予了中藥方劑作用的科學(xué)性,而且已成為新型中藥新藥研究的主要參考依據(jù)之一。如將某些成分作為新藥的指標(biāo)成分或有效成分用于質(zhì)量監(jiān)測(cè),在五類中藥新藥中,更直接以某一類或幾類成分作為有效部位,這些標(biāo)準(zhǔn)的建立通常有賴于中藥化學(xué)和分析方法手段的建立與成熟。在活性評(píng)價(jià)方面,通常采用拆方、單方及提取分離化學(xué)成分直接進(jìn)行,但對(duì)于方劑中某一成分在全方作用中的地位及其與其他成分的相互作用,如協(xié)同、拮抗等,尚缺少理想的手段。眾所周知,中藥方劑是一個(gè)十分龐大的化學(xué)成分大復(fù)方,除前述的各類化學(xué)物質(zhì)外,還包括一些通常被認(rèn)為是無(wú)效或未被認(rèn)定為有效的物質(zhì)成分,如鞣質(zhì)、黏液、色素、無(wú)機(jī)離子等。如何評(píng)價(jià)成分是否具有活性,除了直接獲取成分進(jìn)行試驗(yàn)外,似乎沒(méi)有更好的辦法。其中一些成分的分離純化和活性證明均十分困難,即使是常見(jiàn)的成分也受到含量多少、分離純化方法等因素的制約。因此,要闡明所有成分的活性似乎是不可能的,更何況成分之間本應(yīng)該存在各種相互作用,后者正是中藥方劑整合作用的根本。鑒于中藥方劑整合調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn),我們認(rèn)為,方劑的研究應(yīng)兼顧物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明及物質(zhì)基礎(chǔ)間的相互作用。前者比較容易進(jìn)行且已取得很大的進(jìn)展,后者的證明則十分困難。這不僅因?yàn)槲镔|(zhì)基礎(chǔ)眾多,還由于對(duì)主要物質(zhì)基礎(chǔ)與次要物質(zhì)基礎(chǔ)甚至無(wú)關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)的界定十分困難,而物質(zhì)基礎(chǔ)間的相互作用則使情況更加復(fù)雜。因此,目前對(duì)于中藥成分在方劑中的作用尚缺少理想的評(píng)價(jià)方法,雖有拆方的方法,但無(wú)拆成分的方法;雖有使用成分進(jìn)行直接評(píng)價(jià)活性的方法,但欠缺成分與全方整合作用關(guān)系的評(píng)價(jià)方法。這些欠缺在一定程度上制約了對(duì)中藥方劑的深入評(píng)價(jià)。基于這些考慮,我們數(shù)年來(lái)作了一些探索,取得了一些經(jīng)驗(yàn),可為方劑中成分間的相互作用提供參考。下面以疏肝解郁的基本方四逆散的研究為例,淺談一些思路。2逆散改善肝損傷的作用機(jī)理復(fù)方的多成分、多作用環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)等特點(diǎn)已為人們所接受,這些成分是如何作用的?有無(wú)主次之分?互相之間有無(wú)影響?等等,這些問(wèn)題是闡明方劑作用的重要組成部分。我們從整體作用到細(xì)胞和分子水平的活性,從全方的作用到藥對(duì)、從單體成分的配伍到成分的特異性剔除等多個(gè)角度探討了四逆散的作用。以肝炎為例,肝內(nèi)免疫反應(yīng)已被公認(rèn)為造成肝損傷的重要機(jī)制之一,對(duì)于肝炎的治療來(lái)說(shuō),不僅需要抗病毒藥,還需要保肝藥物以及能抑制肝內(nèi)免疫應(yīng)答的藥物。這說(shuō)明復(fù)雜的病情要求有多種治療方案,從研究角度,就需要有多種的評(píng)價(jià)體系相對(duì)應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn),四逆散對(duì)四氯化碳、卡介苗加脂多糖以及三硝基氯苯導(dǎo)致遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(PCl-DTH)等不同機(jī)理所致的肝損傷均有顯著的改善作用,其中PCl-DTH肝損傷系我們研究室首創(chuàng),通過(guò)對(duì)該模型的研究及比較四逆散對(duì)其他模型的作用,我們認(rèn)為,肝炎中肝細(xì)胞的損傷至少包括效應(yīng)細(xì)胞/分子和靶肝細(xì)胞兩方面的因素,藥物改善肝損傷既可通過(guò)被動(dòng)地保護(hù)肝細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn),也可通過(guò)主動(dòng)地消除引起肝細(xì)胞損傷的因素,包括消除肝浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的功能等。四逆散改善肝損傷的作用機(jī)理正是包含了保護(hù)肝細(xì)胞膜和抑制肝浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞兩個(gè)方面。這種集被動(dòng)和主動(dòng)效應(yīng)于一體的活性使四逆散對(duì)于肝損傷的綜合療效得以發(fā)揮,亦提示方劑研究應(yīng)根據(jù)疾病的性質(zhì)而選擇相應(yīng)的復(fù)數(shù)評(píng)價(jià)指標(biāo),甚至建立新的評(píng)價(jià)體系。在這些作用中,四逆散全方用藥作用明顯優(yōu)于各單味中藥;各單味藥中,肝細(xì)胞膜保護(hù)作用以柴胡較強(qiáng),甘草次之,白芍與枳實(shí)較弱;對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響以白芍較強(qiáng),甘草次之,柴胡與枳實(shí)較弱。提示方中各組成中藥分別作用于肝損傷過(guò)程的不同環(huán)節(jié),全方作用優(yōu)于各單味中藥系其對(duì)疾病過(guò)程中不同靶點(diǎn)綜合效應(yīng)的結(jié)果。四逆散的其他藥效學(xué)試驗(yàn)(如對(duì)接觸性皮炎的抑制作用)及其機(jī)理亦體現(xiàn)出類似的特點(diǎn),即不同成分具有不同的作用,因篇幅所限,這里不作詳細(xì)闡述。這些結(jié)果表明,方劑中的不同藥物具有不同的功能,絕非某些單一指標(biāo)所能囊括,需要多指標(biāo)的評(píng)價(jià)體系。這些功能的主要承擔(dān)者顯然與其所含化學(xué)成分有關(guān),如何進(jìn)一步探討眾多成分的作用應(yīng)是方劑研究的重點(diǎn)之一。3柴胡皂苷a的細(xì)胞活化作用為探討四逆散中成分在其中的作用,我們選擇四逆散4個(gè)組成中藥的4個(gè)代表性成分柴胡皂苷a、芍藥苷、柚皮苷、甘草酸,分別探討了這些成分的效應(yīng),并檢測(cè)了其在四逆散中的含量,分別為四逆散水提取物重量的1.2%、1.4%、7.9%和2.1%。柴胡皂苷a、柚皮苷、甘草酸均可顯著抑制耳腫脹,其中以柴胡皂苷a的作用最強(qiáng),甘草酸次之,而芍藥苷基本無(wú)影響。從抑制耳腫脹程度來(lái)看,各單體成分的作用弱于全方。四逆散及各主要單體成分對(duì)ConA所致脾淋巴細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,其中以柴胡皂苷a和甘草酸作用較顯著,芍藥苷次之,柚皮苷無(wú)明顯影響。對(duì)于接觸性皮炎模型的活化T淋巴細(xì)胞,四逆散、柴胡皂苷a、芍藥苷、甘草酸均能顯著抑制其移動(dòng)能力及MMP-2和MMP-9的分泌;四逆散、柴胡皂苷a還能顯著抑制其粘附能力,芍藥苷、甘草酸僅有抑制的趨勢(shì),而柚皮苷則無(wú)明顯影響。這些結(jié)果提示,對(duì)于上述T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程的各個(gè)指標(biāo),柴胡皂苷a作為君藥柴胡的主要成分作用最為顯著,芍藥苷次之。上述4個(gè)成分分別在不同的指標(biāo)上顯示了它們的活性,一方面證實(shí)了它們本身的作用,另一方面也說(shuō)明這些成分在一定程度上分別代表了柴胡、芍藥、枳實(shí)、甘草的某些作用甚至是主要作用,可以說(shuō)它們是這些藥物的主要效應(yīng)成分。然而,我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)了這樣一個(gè)問(wèn)題,四逆散中的柴胡皂苷a與柴胡皂苷a單獨(dú)使用時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞粘附作用及增殖反應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)存在較大的差異,即柴胡皂苷a單獨(dú)使用要達(dá)到與所含同等量柴胡皂苷a的四逆散同樣的抑制效果,其濃度要大得多,這表明四逆散中的其它成分協(xié)同了柴胡皂苷作用的發(fā)揮。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對(duì)于闡明方劑的作用十分重要,提示方劑中成分間存在著相互作用,這種作用既有協(xié)同的,也有拮抗的,既有通常認(rèn)為的有效成分間的作用,也存在有效成分與“無(wú)效”成分間的相互作用。這些現(xiàn)象也迫使我們不得不考慮這樣的問(wèn)題:除現(xiàn)有的拆方、分離有效成分等的研究模式外,方劑研究還應(yīng)該采用什么樣的方法研究成分的作用?能否進(jìn)行拆成分的研究?為探討這些相互作用,我們還是先從配伍出發(fā)。4逆散的整體作用機(jī)理我們以三硝基氯苯導(dǎo)致小鼠接觸性皮炎模型(PCl-CS)探討了四逆散對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)不同階段的影響,并從四逆散所含的藥對(duì)出發(fā),研究了方中的藥對(duì)配伍。根據(jù)方劑配伍理論,四逆散中至少包含了三個(gè)以上配伍特色明顯的藥對(duì):柴胡-芍藥(一散一收)、柴胡-枳實(shí)(一升一降)、芍藥-甘草(經(jīng)典鎮(zhèn)痛方)。鑒于藥對(duì)是最小、最簡(jiǎn)單的復(fù)方,一個(gè)藥對(duì)也可存在于多個(gè)復(fù)方當(dāng)中,了解它們的作用規(guī)律,不僅可以揭示方劑作用的特點(diǎn)及其配伍的科學(xué)內(nèi)涵,而且可為重組復(fù)方提供科學(xué)依據(jù)。與此同時(shí),藥對(duì)配伍又是探討方劑中各藥味相互作用的重要途徑。我們發(fā)現(xiàn),于誘導(dǎo)相給藥時(shí),柴胡-芍藥、芍藥-甘草、四逆散可顯著減輕耳腫脹,柴胡-枳實(shí)僅有抑制的趨勢(shì);體外可抑制ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖及混合淋巴細(xì)胞增殖,減少IL-2的產(chǎn)生。這些效應(yīng)中,以四逆散和柴胡-芍藥的作用較強(qiáng),芍藥-甘草次之,柴胡-枳實(shí)則無(wú)影響;于誘導(dǎo)相給藥可顯著降低TNF-α和NO的水平,以四逆散和柴胡-芍藥作用最為顯著;四逆散、柴胡-芍藥還可顯著抑制活化的T細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9,柴胡-枳實(shí)、芍藥-甘草無(wú)顯著影響;對(duì)于活化T淋巴細(xì)胞粘附能力的抑制作用,亦以柴胡-芍藥和四逆散的作用較強(qiáng),柴胡-枳實(shí)次之,芍藥-甘草較弱。以上結(jié)果表明,對(duì)于上述T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程的各個(gè)指標(biāo),各藥對(duì)的作用表現(xiàn)不一,主要以君臣配伍的柴胡-芍藥的作用最為顯著,甘草有一定協(xié)同作用。這在一定程度上闡明了四逆散疏肝解郁、治療炎癥性疾病的作用機(jī)理,更為重要的是,通過(guò)藥對(duì)活性的比較,證實(shí)了四逆散組方的合理性,尤其是君臣兩藥柴胡-芍藥的配伍在大多數(shù)藥效中的作用均較強(qiáng),這為其配伍規(guī)律研究打下了的基礎(chǔ)。接著,我們考察了四逆散中主要活性成分的配伍。四逆散各單味藥的化學(xué)成分及主要有效成分的研究相對(duì)明確,為探討全方物質(zhì)基礎(chǔ)及其相互變化的規(guī)律提供了寶貴的信息。根據(jù)上述的4個(gè)代表性成分柴胡皂苷a、芍藥苷、柚皮苷、甘草酸藥理研究結(jié)果,同時(shí)根據(jù)HPLC測(cè)得它們?cè)谒哪嫔⒅械暮?按它們?cè)诜街兴己績(jī)蓛膳湮?于誘導(dǎo)相聯(lián)合給藥,發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a-芍藥苷、柴胡皂苷a-柚皮苷、芍藥苷-甘草酸均可顯著減輕小鼠耳腫脹,抑制picrylchloride體內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞的移動(dòng)能力,并呈現(xiàn)出明顯的藥效協(xié)同作用,以柴胡皂苷a-芍藥苷配伍協(xié)同作用最為顯著。進(jìn)一步將4個(gè)單體成分按方中比例同時(shí)聯(lián)合給藥,發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用更為顯著。那么,這一協(xié)同作用又是如何實(shí)現(xiàn)的呢?是否與這些主要活性成分在體內(nèi)的相互作用有關(guān)?5逆散的總作用機(jī)理中藥及其方劑中活性成分的研究,通常需要分離有效成分或有效部位,其中對(duì)于活性成分的認(rèn)定都是基于單體化合物的藥理學(xué)研究,這一做法的最大好處是直接反映了該化合物所具有的各種藥理活性,易于重復(fù)且比起粗制劑容易做出量效關(guān)系,因此一直作為中藥及方劑物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容之一受到重視。但是這種研究模式同樣存在著缺陷,比如它不能確切反映該成分在全方背景下的實(shí)際作用,更不能了解其在方中與其他成分的相互作用及其結(jié)果。在這樣的背景下,我們思考能不能建立一種探討某一成分或某些成分在方劑中作用的新方法?受基因剔除和基因沉默等技術(shù)的啟發(fā),我們考慮將某一成分從方劑中特異性地除去,而保留其他所有成分(包括通常認(rèn)為是有效的和無(wú)效的成分)不變。先從甘草酸出發(fā),嘗試制作了針對(duì)甘草酸的免疫親和柱,從而將甘草酸從四逆散全方中選擇性地剔除,來(lái)反向研究甘草酸在四逆散全方抑制遲發(fā)型免疫反應(yīng)中的地位和作用,以期為將來(lái)更深入的方劑研究打下基礎(chǔ)。我們首先制作了抗甘草酸的多克隆抗體,將甘草酸與BSA偶聯(lián),合成完全抗原,紫外分光光度法證實(shí)該人工抗原同時(shí)具有載體蛋白和甘草酸的特征吸收峰。經(jīng)SDS法鑒定,證實(shí)載體蛋白上已連接有一定數(shù)目的甘草酸分子,再根據(jù)紫外光譜法和考馬思亮藍(lán)法計(jì)算抗原中甘草酸與BSA的連接數(shù)目。用該抗原免疫新西蘭兔后得到抗血清,為IgG組分,抗體的效價(jià)達(dá)1ue5fe30000。得到抗甘草酸的抗體后,我們應(yīng)用其剔除中藥中的甘草酸,這是基于抗原-抗體反應(yīng)的特異性,基于此原理產(chǎn)生的免疫親和色譜柱既能應(yīng)用于物質(zhì)分離亦能應(yīng)用于成分分析。對(duì)于中藥成分的單克隆或多克隆抗體,已有一些實(shí)驗(yàn)室制作,以ELISA用于檢測(cè)中藥或方劑中成分的定性定量評(píng)價(jià),這對(duì)于中藥的品種鑒定及質(zhì)量檢測(cè)具有重要意義,但將中藥成分的特異性抗體用于剔除中藥或方劑中的特定成分,從而反向探討該成分的作用,則系本課題組首次進(jìn)行。本研究中,我們將純化抗體與Sepharose4B凝膠偶聯(lián),制備抗甘草酸的免疫親和柱,然后加四逆散提取物過(guò)柱,獲得的樣品中甘草酸含量顯著下降,下降率達(dá)95.5%,表明甘草酸已從四逆散全方中選擇性地剔除。接下來(lái)我們考察了剔除甘草酸后的四逆散樣品對(duì)接觸性皮炎小鼠脾細(xì)胞粘附IV型膠原的影響,四逆散和甘草酸均具有顯著的抑制作用,而四逆散剔除甘草酸后的樣品僅顯示出輕微的抑制作用。換言之,甘草酸的剔除降低了四逆散對(duì)淋巴細(xì)胞粘附的抑制作用,表明甘草酸在四逆散抑制淋巴細(xì)胞粘附過(guò)程中起著主要作用。此外,剔除甘草酸亦可顯著阻斷四逆散對(duì)抗原致敏小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9的抑制作用。除甘草酸外,四逆散中還包括一些其他的活性成分。例如,柴胡中的柴胡皂苷具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、影響T細(xì)胞功能、保肝、抗病毒、抗腫瘤等作用;白芍中芍藥苷可調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛及保肝;枳實(shí)中柚皮苷具有抗氧化作用等。如前所述,四逆散的治療效果體現(xiàn)了許多化學(xué)成分的整合效應(yīng),嘗試從中藥方劑中選擇性地剔除一個(gè)或多個(gè)化學(xué)成分,將有助于闡明中藥方劑的作用機(jī)理。我們還用同樣方法制作了剔除柴胡皂苷、柚皮苷和芍藥苷后的四逆散樣品,這些抗體均具有很高的特異性。如抗柚皮苷抗體與芍藥苷、柴胡皂苷a和甘草酸的交叉反應(yīng)率均<1%,與橙皮苷的交叉反應(yīng)率<2%,成功剔除柚皮苷后的四逆散樣品中,未觀察到其他峰的明顯變化,可以認(rèn)為免疫親和柱對(duì)柚皮苷的剔除是特異性的,對(duì)柚皮苷以外的其他成分基本無(wú)影響。通過(guò)這樣的方法探討某個(gè)成分被特異性剔除后的效應(yīng)變化,反過(guò)來(lái)推測(cè)該成分在方中的作用,我們?cè)卺槍?duì)芍藥苷的研究中則遇到了挑戰(zhàn),進(jìn)一步揭示了這種反向研究方式的必要性:在一些指標(biāo)的檢測(cè)中,芍藥苷的剔除并不影響四逆散的作用,而芍藥苷本身單獨(dú)使用則有這些作用,提示芍藥苷并非這些作用的主要擔(dān)當(dāng)成分,經(jīng)過(guò)多次探索,發(fā)現(xiàn)芍藥苷的剔除在其他一些指標(biāo)方面使四逆散的作用大大減弱,很顯然,芍藥苷后者的作用對(duì)于四逆散作用的貢獻(xiàn)更大,這個(gè)認(rèn)識(shí)用以往的方法是很難獲取的。這一實(shí)踐進(jìn)一步證實(shí)了中藥方劑成分的多靶點(diǎn)和多環(huán)節(jié),為闡明成分在方劑中實(shí)際作用的研究提供了新的方法。同時(shí),這種免疫親和層析特異性地剔除中藥中特定成分的方法,對(duì)