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宇佐美曲霉aus-amii-cf1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

中國是一個擁有大量水果的大國,每年都會生產(chǎn)大量水果的副產(chǎn)品。柑橘皮富含果膠、纖維素、可溶性糖及多種礦物質(zhì)元素,是一種良好的微生物生長基質(zhì)。目前,對柑橘皮的研究主要集中在內(nèi)含成分的提取,對利用微生物發(fā)酵柑橘皮生產(chǎn)酶制劑的報道較少。吳厚玖等(1997)開展了柑橘皮渣發(fā)酵飼料中間試驗研究,Ismail(1996)對微生物液體發(fā)酵柑橘皮產(chǎn)酶進行研究。用柑橘皮為原料,固體發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶制劑的方法在國內(nèi)外未見報道。我們的試驗旨在研究酶系較全、產(chǎn)酶水平較高的宇佐美曲霉A.usamii-CF1利用柑橘皮進行固體發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。1材料和方法1.1固體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基菌種:實驗室選育菌株A.usamii-CF1。斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):20%土豆汁、2%葡萄糖、1.8%瓊脂,自然pH值。固體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(簡稱基礎(chǔ)培養(yǎng)基):干燥橘皮粉4g、豆粕1g、尿素0.1g、水10ml,自然pH值。試劑:DNS試劑、0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值4.8)、0.1M乳酸-乳酸鈉緩沖液(pH值為3.0)、福林試劑(Folin試劑)、0.4M碳酸鈉溶液、0.4M三氯乙酸溶液、2%酪蛋白溶液(pH值為3.0)、100μg/ml酪氨酸溶液。1.2方法1.2.1發(fā)酵溫度對各種酶的影響在250ml三角瓶中,裝入固體發(fā)酵培養(yǎng)基,攪拌均勻,121℃滅菌20min,冷卻后接入由斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后制成的濃度為107個/ml的孢子懸浮液1ml,置于28℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)60h,測定各種酶的酶活。1.2.2酶提取酶取一定量的發(fā)酵固體,加入10倍發(fā)酵固體量的蒸餾水,間歇攪拌1.5h,一層濾紙過濾得粗酶液,用蒸餾水稀釋后作酶測定用。1.2.3蛋白酶活力測定纖維素酶[羧甲基纖維素(CMC)酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶(FPA)]測定采用DNS法。酶活定義為:在pH值為4.8,溫度為50℃條件下,每分鐘水解各底物產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量為1個纖維素酶活力。酸性蛋白酶活力測定采用福林酚法。酶活定義為:在pH值為3.0,溫度為40℃條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量,定義為1個蛋白酶活力單位(U)。木聚糖酶的活性測定采用李彩霞(2001)介紹的方法。酶活定義為:在pH值為4.8,溫度為50℃的條件下,每分鐘產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活力單位(U)。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基含水量對不同酶活性的影響用不同水分含量的培養(yǎng)基進行發(fā)酵試驗,發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶的酶活(結(jié)果見圖1)。從圖1可以看出:培養(yǎng)基含水量對各種酶組分產(chǎn)酶量具有顯著性影響,CMC酶在水分含量60%時產(chǎn)酶活性最高;而FPA酶酶活和β-葡萄糖苷酶在水分含量在55%時產(chǎn)酶活性最高;木聚糖酶在水分含量60%~70%時產(chǎn)酶活性較穩(wěn)定;酸性蛋白酶在水分含量50%~55%時產(chǎn)酶活性最高。本文綜合考慮各種復(fù)合酶酶活,取培養(yǎng)基含水量為55%~60%為最佳。2.2起始ph值對菌株產(chǎn)酶的影響用不同起始pH值的培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶試驗,試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)培養(yǎng)基起始pH值低于5時對菌株產(chǎn)酶有一定影響,而在高于5較廣的pH值范圍內(nèi)(pH值5.0~9.0)對菌株產(chǎn)酶影響不大。經(jīng)測定,基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基提取液的自然pH值是5.40,因此,本研究以自然pH值為最終的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)pH值。2.3麩皮添加量對木聚糖酶活的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1g不同種類的碳源進行產(chǎn)酶試驗(見圖3)。由圖3結(jié)果顯示,添加麩皮有利于纖維素酶酶活和酸性蛋白酶酶活的提高,但所有的輔助碳源的添加都不利于木聚糖酶酶活的提高。經(jīng)綜合考慮,確定添加少量的麩皮作為培養(yǎng)基的輔助碳源。2.4氮源對葡萄糖苷酶產(chǎn)酶率的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.05g不同氮源進行發(fā)酵試驗(見圖4)。由圖4結(jié)果顯示,氮源的添加對復(fù)合酶的生產(chǎn)具有顯著影響。添加各種氮源都能明顯提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)酶率,其中(NH4)2SO4、NH4NO3、CO(NH)2和Mg(NO3)2能提高一倍以上。NH4NO3和CO(NH)2能較大幅度的提高FPA產(chǎn)量(分別比對照提高了29%和50%)。各種氮源對CMC酶活的提高效果都不大,所添加的氮源除了(NH4)2SO4外對木聚糖酶都有一定的抑制作用。不同氮源對酸性蛋白酶的影響較大,其中CO(NH)2對酸性蛋白酶的產(chǎn)生具有較大的促進作用(產(chǎn)酶率提高31.2%)。2.5柑橘皮提取物的酶活將柑橘皮粉與豆粕配制成不同的比例進行發(fā)酵試驗(見圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)不添加豆粕的時候,幾乎不產(chǎn)酸性蛋白酶。當(dāng)柑橘皮粉與豆粕的比例為8:2時,CMC酶、濾紙酶和木聚糖酶分別已經(jīng)達到了酶活最高值;當(dāng)柑橘皮粉與豆粕的比例為7:3時,酸性蛋白酶達到了酶活最高值;當(dāng)柑橘皮粉與豆粕的比例為6:4時,β-葡萄糖苷酶達到最高值。綜合考慮,認(rèn)為柑橘皮粉與豆粕比例為7:3較合適。2.6酸性蛋白酶酶活在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加0.1g的各種無機鹽。結(jié)果見表1。從表1可以看出,CaCl2對纖維素酶有提高作用,但對木聚糖酶有抑制作用;KH2PO4、K2HPO4能提高酸性蛋白酶酶活,但是對羧甲基纖維素酶和木聚糖酶有一定的抑制作用;Na2HPO4和NaH2PO4能使木聚糖酶酶活提高,且具有顯著性差異,但是Na2HPO4對酸性蛋白酶有一定的抑制作用。MnSO4的添加能提高各類酶活,但不具有顯著性差異,綜合考慮各類無機鹽對復(fù)合酶的影響,確定在培養(yǎng)基中添加MnSO4和Na2HPO4各0.1g。2.7最佳條件穩(wěn)定性試驗用柑橘皮粉53%、豆粕23%、麩皮19%、尿素1%、Na2HPO42%、MnSO42%以及水分含量為55%~60%的培養(yǎng)基進行淺盤擴大發(fā)酵試驗,經(jīng)干燥將所得發(fā)酵產(chǎn)物制成酶制劑粗制品。該粗制品為灰褐色粉末,易溶于水。各酶組分的活力分別為:CMC酶41.6U/g、β-葡萄糖苷酶102.2U/g、木聚糖酶2079.6Ug、酸性蛋白酶7884

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