第三講 病毒的遺傳變異

病毒的一步生長曲線（one-stepgrowthcurve）

感染比（multiplicityofinfection,MOI）是指在一個系統(tǒng)中感染病毒的細胞數(shù)與細胞總數(shù)之比。在人工培養(yǎng)的細胞中，接種高MOI的病毒，使所有細胞幾乎同時受到病毒感染，如分析該培養(yǎng)系統(tǒng)中的單個細胞，就可以代表病毒在整個體系中所有細胞生長的情況。應用這一方法，可獲得病毒一步生長曲線試驗的結(jié)果（圖22-1），觀察到病毒具有復制周期（replicationcycle）。一個完整的復制周期包括吸附、穿入與脫殼、生物合成、組裝與釋放等步驟。病毒感染細胞之后的一個短時間內(nèi)，病毒完全消失，甚至在細胞內(nèi)也找不到傳染性的病毒顆粒，直至感染數(shù)小時后子代病毒出現(xiàn)為止，這階段稱為隱蔽期（eclipseperiod），一般持續(xù)2~12h。

在病毒的遺傳與變異Whatisagene?StablesourceofinformationAbilitytoreplicateaccuratelyCapableofchange基因激活轉(zhuǎn)錄起始翻譯后加工翻譯RNADNAPr轉(zhuǎn)錄后加工mRNA降解細菌

外源性的遺傳物質(zhì)由供體菌進入受體菌細胞內(nèi)的過程稱為基因轉(zhuǎn)移（genetransfer)；轉(zhuǎn)移的基因與受體菌DNA整合在一起稱為重組(recombination)。細菌基因轉(zhuǎn)移和重組的主要方式有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合。FrederickGriffith’sTransformationExperiment-1928“transformingprinciple”demonstratedwithStreptococcuspneumoniae病毒第一節(jié)突變第二節(jié)誘變第三節(jié)基因重組第四節(jié)病毒基因產(chǎn)物間的相互作用準種：由一種母序列和來自該序列的大量突變基因組所組成的病毒群體。表型的一致性，遺傳的動態(tài)差異，在變異中保持穩(wěn)定。突變

病毒復制過程中單個或者成段的核苷酸序列發(fā)生替換、缺失、插入等現(xiàn)象。缺損型干擾（defectiveinterfering，DI）突變株，突變的特例缺損型干擾(defectiveinterfering,DI)突變株

這是一種缺失突變的產(chǎn)物。自身不能復制,只有在親本野生株作為輔助病毒存在時才能復制,但又干擾親本病毒的復制,導致后者數(shù)量減少。含正常的衣殼蛋白質(zhì)只含有正?；蚪M的一部分只能在正常同源病毒同時存在時才能繁殖,這時同源病毒成為輔助病毒(helpervirus)特異性地干擾同源病毒的繁殖,經(jīng)連續(xù)傳代后,DI顆粒增多突變率和適應性迅速復制的能力較高的胞內(nèi)滴度特定細胞受體的選擇慢性感染以及隱性感染逃避防御機制傳播方式的適應誘變病毒復制時前者可摻入RNA病毒的核酸，后者可摻入DNA病毒的核酸。定點誘變，在預定的序列位置上插入核苷酸。1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。

2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。

3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。

4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。

5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì).

基因重組分子內(nèi)重組重配

將兩個有親緣關(guān)系但生物學性狀不同的毒株感染同一個宿主細胞，從而可發(fā)生核酸水平上的互換，產(chǎn)生兼有兩親本特性的子代，稱為重組。一、分子內(nèi)重組分子內(nèi)重組：兩種密切的相關(guān)但序列不同的病毒核苷酸

病毒與病毒病毒與細胞Recombinationbybreak-rejoinofincompletelylinkedgenes

重配大多數(shù)情況下特指基因組分節(jié)段的RNA病毒，砂粒病毒雙RNA病毒布尼病毒正黏病毒以及呼腸孤病毒。兩個進化相近的毒株感染同一細胞是，兩者發(fā)生了基因的交換，產(chǎn)生穩(wěn)定或可變的重配毒株。二、重配(reassortment)

Reassortmentbyindependentassortmentduringdualinfection病毒進化的例證粘液瘤病毒與宿主的共同進化甲型流感病毒的抗原性轉(zhuǎn)移以及漂移重組的甲型流感在人群中三次大流行：1918年西班牙流感

1957年亞洲流感1968年香港流感

人類的感染流感期間CampFunston的緊急軍事醫(yī)院。禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）1901年即分離禽流感病毒，但直到1955年才明確它與人及哺乳動物流感的關(guān)系，20世紀70年代開始注意在水禽廣泛存在的禽流感病毒是流感病毒的“基因庫”，并對家禽業(yè)構(gòu)成潛在威脅。禽流感的高致病力毒株對雞有致病性，舊稱“真性雞瘟”（fowlplague），現(xiàn)名高致病性禽流感（Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI）是OIE規(guī)定的通報疫病。病毒毒力有很大差異。高致病力毒株主要有H5N1和H7N7亞型的某些毒株。禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不經(jīng)過豬體混合重配再傳染的過程，直接感染人。國外學者認為，在中國南部生活著密集的人群及養(yǎng)殖大量的豬和鴨，彼此密切接觸提供了上述的機遇。其實除華南之外，東南亞也具有類似情況，2004年禽流感在該地區(qū)的廣泛流行，似可為佐證。野生水禽是禽流感病毒的基因庫病毒的變異甲型流感病毒變異的顯著特點是HA和NA發(fā)生遺傳性或抗原性漂移（geneticorantigenicdrift）遺傳性或抗原性轉(zhuǎn)移（geneticorantigenicshift）抗原性變異是HA和NA二者的遺傳性或抗原性漂移（geneticorantigenicdrift）及遺傳性或抗原性轉(zhuǎn)移（geneticorantigenicshift）導致的。漂移發(fā)生在某個亞型之內(nèi)，是點突變的積蓄，其中和表位與未突變株稍有差異。轉(zhuǎn)移則驟然獲得一個全新的HA或NA基因，從而產(chǎn)生新的亞型，可能在全世界引致新型流感的暴發(fā)流行。

隨機突變基因組節(jié)段交換流感病毒抗原性漂移及轉(zhuǎn)移示意（據(jù)Harper）漂移轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移源于禽類的甲型流感病毒在人體很難增殖，反之亦然二者均能在豬體內(nèi)增殖，并在豬體內(nèi)進行基因重配，豬體是人流感毒株與禽流感毒株的混合器，在豬體內(nèi)流感病毒產(chǎn)生抗原性轉(zhuǎn)移甲型流感病毒傳播的

經(jīng)典模式毒力變異的分子基礎(chǔ)HA是否富含堿性氨基酸。HA裂解為HA1和HA2，暴露融合肽段，通過融合進入宿主細胞。高致病力毒株與低致病力毒株的H裂解位點的氨基酸序列有差異，前者為-X-X-精氨酸-X-精氨酸/賴氨酸-精氨酸-（X為非堿性氨基酸），而低毒株僅有單個精氨酸，蛋白酶切割率極低，不易裂解。NA26個氨基酸的缺失及PB2蛋白氨基酸的突變也影響病毒的毒力。毒力變異的分子基礎(chǔ)HA是否富含堿性氨基酸。HA裂解為HA1和HA2，暴露融合肽段，通過融合進入宿主細胞，為入侵的關(guān)鍵步驟。高致病力毒株HA的切割位點有多個氨基端毗連，決定該病毒可被機體大多數(shù)組織細胞的蛋白酶裂解。低致病力的裂解位點均只有一個單一的堿性氨基酸—精氨酸，只能被胰蛋白酶切割，存在于消化道和呼吸道。球體表面糖基化位點（影響細胞親和性），多聚酶復合體的作用（H5N1,NS1變化，破壞細胞內(nèi)關(guān)鍵信號的轉(zhuǎn)導通道）等。蛋白酶

催化蛋白質(zhì)水解的酶類。種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶對所作用的反應底物有嚴格的選擇性，一種蛋白酶僅能作用于蛋白質(zhì)分子中一定的肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵1983年4月在美國賓州發(fā)現(xiàn)低毒力的禽流感H5N2，致死率低于10%，它與當時美國東部從野鳥分離的H5N2基因很相似同年10月，H5N2毒株的致死率突然上升至80%。將4月及10月的兩毒株比較，發(fā)現(xiàn)毒力的變異是因點突變所致，亦即發(fā)生抗原性漂移表現(xiàn)為H基因的7個核苷酸二者有差異，從而導致H蛋白的4個氨基酸改變，有利H0的裂解及活化，致使毒力增強HA和NA兩個基因上的變異可以隨時間的延長而發(fā)生積累，但是流感病毒其他基因的變異在短期內(nèi)似乎并不隨時間的延長