黃芪對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用機(jī)制

黃芪對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用機(jī)制

氧化應(yīng)激是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制之一。臨床與實(shí)驗(yàn)研究都發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗氧化劑可延緩糖尿病腎病進(jìn)程。黃芪提取物主要成分黃芪總酮、黃芪總皂甙等其藥理作用有較強(qiáng)的抗氧化作用,初步發(fā)現(xiàn)其能降低蛋白尿,改善腎小球結(jié)構(gòu)異常。本研究旨在進(jìn)一步探討黃芪對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)機(jī)制,為黃芪在糖尿病腎病的治療提供更加有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1免疫組化檢測(cè)腎皮質(zhì)中k-n-sod和gsh-px、mda、nos的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)于2005年1月～2005年5月取健康雄性wistar大鼠,體重200～250g,30只。隨機(jī)抽取20只禁食12h,采用60mg·kg-1STZ溶于0.1mmol·L-1檸檬酸緩沖液一次性腹腔注射,對(duì)照組則注射等量的檸檬酸緩沖液。連續(xù)監(jiān)測(cè)血糖3d,持續(xù)血糖濃度>16.6mmol·L-1,確定為糖尿病模型形成。將大鼠分為3組。A組:空白對(duì)照組(n=10);B組:糖尿病模型組(n=10);C組:糖尿病6周后+黃芪注射液(中科院成都地奧制藥公司生產(chǎn))組(n=10)。C組6周后20mg·kg-1·d-1,尾靜脈注射給藥。不應(yīng)用胰島素,整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察8周。實(shí)驗(yàn)開始后第1,8周將動(dòng)物分別放入代謝籠收集24h尿液,測(cè)定尿量,并用1%戊巴比妥鈉1.0ml腹腔注射麻醉,心臟抽血2ml。測(cè)定血肌酐、計(jì)算肌酐清除率。用酶標(biāo)法計(jì)算尿微量白蛋白排泄率(UAE)。8周后將動(dòng)物處死,取左側(cè)8mm3腎皮質(zhì)在分析天平上稱重,制成10%組織勻漿,離心,測(cè)定腎皮質(zhì)SOD、GSH-Px、MDA、NO2-/NO3-和NOS。取右側(cè)腎臟用1%福爾馬林固定,經(jīng)脫水、透明石蠟包埋、切片3μm行PAS染色及5μm行Ⅳ膠原免疫組化制片,光鏡檢查。⑴腎皮質(zhì)NO2-/NO3-和NOS:NO2-/NO3-和NOS含量采用硝酸還原酶法(南京建生成物工程研究所)。⑵腎皮質(zhì)T-SOD和CuZn-SOD、GSH-Px、MDA:T-SOD和CuZn-SOD活性采用聯(lián)苯三酚自氧化法,GSH-Px活性采用NADPH耦聯(lián)法,MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(南京建生成物工程研究所)。⑶腎小球PAS染色病變程度分析:在高倍鏡下順序觀察每張切片皮質(zhì)部分5個(gè)腎小球,用Leica5001W型圖像分析儀定量測(cè)量每個(gè)腎小球面積(GA),腎小球內(nèi)ECM面積。結(jié)果用ECM/GA表示。⑷免疫組化Ⅳ膠原陽性物質(zhì)表達(dá):石蠟切片常規(guī)脫蠟,加入兔抗大鼠Ⅳ膠原多克隆抗體4℃過夜,再加生物素化二抗室溫30min,滴加鏈酶親和素-生物復(fù)合素,室溫30min,滴加DAB顯色液(武漢博士德公司試劑盒),鏡下控制著色時(shí)間,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。陽性物質(zhì)呈棕色帶狀沉積。同樣應(yīng)用上述圖象分析軟件計(jì)算陽性指數(shù)(PI):[陽性信號(hào)面積×平均陽性強(qiáng)度(平均灰度值)]/腎小球面積,取平均值。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示各組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。2各組腎皮質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的變化B、C組大鼠腹腔注射STZ,連續(xù)3d,血糖>16.6mmol·L-1即DM模型形成,以后每周測(cè)定血糖>16.6mmol·L-1,尿糖3+～4+至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。第1周末開始B、C組Ccr、UAE較A組明顯升高(P<0.01)。第8周末B組Ccr較C組明顯降低(P<0.01),A、C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B、C組UAE較A組明顯升高(P<0.01),C組較B組明顯降低(P<0.01)(表1)。B、C組腎皮質(zhì)T-SOD、GSH-Px顯著低于A組,但C組較B組明顯升高,B、C組腎皮質(zhì)MDA含量顯著高于A組,但C組較B組明顯降低。B組腎皮質(zhì)NO2-/NO3-和NOS顯著低于A組(P<0.05),C組顯著高B組(P<0.01),A、C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。2·4腎小球病理形態(tài)及免疫組化變化3dm和氧化應(yīng)激作用糖尿病腎病(DN)是在代謝紊亂與血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上,以高糖誘導(dǎo)的活性氧(ROS)、各種生長(zhǎng)因子、血管活性物質(zhì)綜合作用的結(jié)果?；钚匝跬ㄟ^對(duì)腎小球內(nèi)皮、上皮及系膜細(xì)胞的直接損傷和趨化作用,吸引中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞在血管周圍及血管內(nèi)浸潤(rùn),從而改變腎小球毛細(xì)血管和基底膜的通透性及腎小球內(nèi)血液動(dòng)力學(xué),造成大量持續(xù)性蛋白尿。DN發(fā)展中自由基產(chǎn)生不斷增多,體內(nèi)抗氧化酶活性下降,信使蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變,使NO滅活。NO作為內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子可使細(xì)胞外基質(zhì)合成減少,分解增加而防止腎小球基質(zhì)中膠原纖維的積聚。研究發(fā)現(xiàn),腎小球系膜區(qū)和基底Ⅳ膠原在DM時(shí)明顯增加。主要因?yàn)楦咛呛虯GEs使ROS產(chǎn)生,ROS活化PKC、MAPK和JAK-STAT通道,導(dǎo)致氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)染因子如NF-κB,AP-1,STAT和Egr-1迅速活化,從而增強(qiáng)TGF-β和CTGF基因編碼的轉(zhuǎn)活化使ECM蛋白表達(dá)上調(diào)。資料報(bào)道,DM時(shí)NAPCD氧化和eNOS解偶聯(lián)導(dǎo)致腎小球ROS產(chǎn)生,而氧化應(yīng)激可使NOS亞型表達(dá)下調(diào),ROS介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化增加,用胰島素加抗氧化劑能夠使NOS亞型和ROS恢復(fù)正常。體外實(shí)驗(yàn)證明,黃芪水提取物黃芪總酮(TFA)、黃芪總皂甙(TSA)等,均有清除超氧陰離子自由基作用,從而抑制膜脂質(zhì)過氧化。SOD可以歧化O?ˉ2Ο?ˉ2生成H2O保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基的損傷。糖尿病時(shí),腎臟自由基防御機(jī)能下降,腎臟抗氧化酶活性減弱。黃芪抗氧化作用的機(jī)制一方面是對(duì)LPO直接作用,而主要是通過顯著升高SOD活性而清除氧自由基。本研究表明黃芪可明顯減輕糖尿病大鼠蛋白尿,改善腎小球?yàn)V過率,可能是由于黃芪對(duì)氧自由基的清除,使腎小球基底膜損害降低所致。筆者發(fā)現(xiàn)黃芪具有顯著增加NOS活性,增加組織抗氧化酶活性作用,使ROS產(chǎn)生減少,可能通過PKC、MAPK和JAK-STAT通道,減輕糖尿病鼠腎小球GMB增厚及系膜區(qū)基質(zhì)增生,延緩腎小球硬化進(jìn)程,因此認(rèn)為,黃芪作為一種傳統(tǒng)廉價(jià)中草藥,具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。11動(dòng)物和組成12樣品收集13各種指標(biāo)的測(cè)定1小鼠血清中pas活性變化2·1實(shí)驗(yàn)大鼠血糖變化2·2實(shí)驗(yàn)大鼠Ccr、UAE變化2·3氧化應(yīng)激指標(biāo)及NO2-/