水預水解提取液發(fā)酵發(fā)酵酒精的研究

水預水解提取液發(fā)酵發(fā)酵酒精的研究

隨著高油價格和能源可持續(xù)的擔憂，生活生物源越來越受到重視。其中，乙醇可以直接添加到燃料中，因此得到了廣泛的研究。傳統的乙醇生產方法主要采用糧食作物(如玉米)為原料,對糧食安全的擔心促使人們將目光投向農林廢棄物、生活垃圾等生物質原料。木質纖維素類物質是地球上最重要的可再生資源,主要由纖維素、半纖維素和木質素三種化學組分構成,其中半纖維素在制漿闊葉木原料和禾本科植物原料中的含量達20%～30%甚至更高,且以木聚糖為主,D-木糖最高可占原料水解糖類的34%。制漿造紙主要是利用其中的纖維素成分。在傳統的化學法制漿過程中,半纖維素會和木素一起被降解、溶解從而進入制漿廢液,隨后通過在廢液回收系統中的燃燒來回收化學藥品和熱能。由于半纖維素的熱值(13.6MJ/kg)比木素的熱值(27MJ/kg)低,因此如果能使半纖維素不是通過燃燒,而是轉化為有用的生物質產品,則可以大大提高其附加值,不僅有望緩解石油日益枯竭的壓力,同時具有綠色環(huán)保的社會效益,而當前在全球掀起的生物煉制熱潮給制漿造紙工業(yè)的轉型提供了難得的機遇,如何將半纖維素的提取和轉化利用與制漿造紙過程經濟有效地相結合,已經在各國成為探討的熱點課題。本論文結合制漿前水預水解提取半纖維素的方式,對桉木不同預水解工藝條件下提取液中的糖類組分進行分析,并以畢赤酵母與酒精酵母的融合子SHY07-1對提取液的酒精發(fā)酵進行了探索。1材料和方法1.1桉樹葉片聚戊糖持續(xù)聚戊糖桉木水預水解提取液由華南理工大學輕工與食品學院提供。所采用桉木原料為剛果12號桉改良品種(由廣東雷州林業(yè)局提供),其中聚戊糖含量為20.64%。水預水解實驗在美國M/K-609-2-10計算機控制蒸煮器中進行,采用液固比5∶1,水預水解工藝條件見表1。1.2瓊脂糖凝膠電泳斜面培養(yǎng)基:木糖20g/L,酵母粉20g/L,蛋白胨10g/L,瓊脂20g/L。種子培養(yǎng)基:木糖20g/L,酵母粉20g/L,蛋白胨10g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基:桉木水抽提液中加入玉米漿0.3%、MgSO40.05%。115℃條件下滅菌20min。1.3酒精發(fā)酵1.3.1酵母的活化培養(yǎng)-80℃保藏的酵母(畢赤酵母與酒精酵母的融合子SHY07-1,華南理工大學發(fā)酵工程研究室選育保藏)在40℃溫水中迅速解凍后接到滅菌的斜面培養(yǎng)基中,30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-72h。然后將活化的酵母轉接到裝有10mL滅菌種子培養(yǎng)基的試管中,30℃搖床150r/min培養(yǎng)24h。按10%的接種量將試管種子液接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,30℃搖床150r/min培養(yǎng)12-18h,即為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。1.3.2l滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基將1.3.1中的種子液8.0mL接入裝有80mL滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL蓋有膠塞和鋁蓋的血清瓶中,控制溫度在150r/min搖床上培養(yǎng)。每隔24h使用一次性注射器取樣2mL,進行發(fā)酵組分分析。1.4實驗設計與發(fā)酵選定影響酵母酒精發(fā)酵較為顯著的幾個因素(溫度、裝液量、pH和不同條件的桉木水預水解提取液)設計正交實驗,每個因素設3個水平,在血清瓶中進行酒精發(fā)酵試驗。正交因素水平設計見表2。1.5發(fā)酵組分的測定桉木水預水解提取液中木糖、葡萄糖、纖維二糖、乳糖、阿拉伯糖等的分析采用液相色譜法進行分析。2mL提取液在5000r/min條件下離心10min,取上清液1ml,然后用0.22μm濾膜過濾,濾液供分析用。液相色譜法進行分析:Waters2414RID監(jiān)測器配2414工作站,Waters1525BinaryHPLCPump,AminexHPX-87P柱(BIORAD,300x7.8mm),柱溫60℃,流動相為超純水,流速0.6mL/min,進樣量:5μL,采用外標法。發(fā)酵組分的分析采用液相色譜法進行分析。2mL發(fā)酵液5000r/min條件下離心10min,取上清液1ml,加入50μL10%的硫酸,然后用0.22μm濾膜過濾,濾液供分析用。液相色譜法進行分析:Waters2414RID監(jiān)測器配2414工作站,Waters1525BinaryHPLCPump,HPX-87H柱(BIORAD,300x7.8mm),柱溫60℃,流動相為含0.0025mol/LH2SO4的超純水,流速0.6mL/min,進樣量:10μL采用外標法。根據分析結果計算酒精得率。酒精得率=乙醇增加量/(木糖減少量+葡萄糖減少量)。2結果與討論2.1半乳糖、阿拉伯糖不同條件下桉木水預水解提取液的糖類組分分析結果如圖1所示。由圖1可知,三種樣品中都含有木糖、葡萄糖、纖維二糖、半乳糖、阿拉伯糖這五種糖,主要糖成分是五碳糖,其中最主要的是木糖。木糖的含量都遠遠高于葡萄糖,尤其提取液160B的木糖含量高達16.56g/L。而葡萄糖和阿拉伯糖含量相對較低(低于1g/L)。根據桉木水預水解提取液成分分析結果可知,普通酵母無法利用桉木水預水解提取液中的五碳糖,所以采用本研究室保藏的SHY07-1進行后面的發(fā)酵研究。2.2不同因素對桉木水預水解提取液c的影響在對桉木水預水解提取液成分分析的基礎上,以酒精得率為指標,采用正交實驗設計方法,選用L9(34)混合正交表,考察溫度(A)、裝液量(B)、桉木水預水解提取液的種類(C)、pH值(D)等因素對發(fā)酵的影響,進行實驗。結果見表3和表4。F0.05(2,8)=4.46F0.1(2,8)=3.11由表3和表4結果分析表明:影響提取液發(fā)酵的因素依次為C>B>D>A,其中C因素具有顯著性差異,其余因素無顯著影響,各因素最佳水平為A2B3C2D1,因此確定以提取液160A為原料在溫度為33℃、裝液量為總體積的4/5、pH值為5.0時,作為發(fā)酵條件。2.3酒精含量測定對正交實驗結果進行驗證。取100mL的血清瓶9個,每三瓶分別裝上樣品150B、160A、160B各80mL,調pH為5.0,置于溫度為33°C、轉速為150r/min的搖床中發(fā)酵。發(fā)酵結束后測定殘?zhí)呛鸵掖己?計算酒精得率,結果見圖2。由圖2可以看出樣品160A所得的酒精得率最高,達到0.42左右,與正交實驗結果吻合。同時從圖3可以看出:48h時三種樣品中的酒精含量已達到最大值,說明酵母SHY07-1能夠較快的利用桉木水預水解提取液中的木糖。2.4發(fā)酵過程中產物的變化酵母在利用糖發(fā)酵產酒精時,常常伴有木糖醇、乳酸和乙酸的生成,通過檢測這三種物質的變化可對其發(fā)酵途徑有進一步的了解。木糖醇、乳酸和乙酸的變化曲線如圖4所示。由圖4中可以看出,發(fā)酵初始,提取液150B、160A、160B的木糖醇、乳酸含量基本一致,木糖醇在0.3g/L-0.4g/L之間;乳酸為1.2g/L-1.4g/L之間;但160B的乙酸含量明顯高于150B和160A,這可能是160B木糖含量高而乙醇得率低的原因之一。隨著發(fā)酵的進行,木糖醇變化不明顯;除160A外,乙酸都是前24h減少,然后趨于平穩(wěn),96h又開始略微下降,總減少量為1.2g/L-1.5g/L之間,而乳酸在24h之后基本都處于平穩(wěn)狀態(tài)。觀察圖3和圖4,可發(fā)現150B和160B中產物成分的在發(fā)酵過程中的變化趨勢相似,160A與它們卻略有不同;但三者的共同特點是當酒精含量增加時都伴有乙酸和乳酸的減少。3不同溫度對桉木水預水解提取液pla、酒精發(fā)酵的影響桉木水預水解工藝條件對提取液樣品的糖類組分有很大的影響,從而影響后面的酒精發(fā)酵。較高溫度下長時間保溫預水解獲得的提取液160B樣品中的木糖含量最高,達到16.56g/L。當溫度為33℃、pH為