細(xì)胞系的建立及鑒定

細(xì)胞系的建立及鑒定2012.2.28細(xì)胞系：有限細(xì)胞系，人的正常組織多數(shù)可以建立有限細(xì)胞系。如間充質(zhì)來源的成纖維細(xì)胞，牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞等無限細(xì)胞系，永生化細(xì)胞系，腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞系/細(xì)胞的鑒定細(xì)胞系的建立：1.組織塊方法2.單層細(xì)胞法原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)大量擴增細(xì)胞后用于實驗研究使用前對細(xì)胞的組織特異性進行鑒定成骨細(xì)胞：沒有唯一的特異性標(biāo)志物

需數(shù)個指標(biāo)聯(lián)合證實表面標(biāo)志：

表達ALP。Gomarri法

合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、骨鈣素、骨粘蛋白、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白。組織功能：

體外形成礦化結(jié)節(jié)。vonKossa染色法

體內(nèi)成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。破骨細(xì)胞：唯一特異性標(biāo)志物破骨細(xì)胞含有豐富的酸性磷酸酶和抗酒石酸磷酸酶（tartratresisitantacidphosphatase,TRAP），TRAP染色陽性是破骨細(xì)胞的重要標(biāo)識。另外破骨細(xì)胞表面有降鈣素（calcitonin）受體，也可以作為標(biāo)志物。形態(tài)學(xué)：多核細(xì)胞干細(xì)胞表面標(biāo)志：CD44,STROL1,MUC-18 ,alpha-SMactin多潛能功能鑒定：成骨細(xì)胞功能：細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性檢測：采用Gomarri法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性。細(xì)胞體外礦化能力的檢測：細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)劑處理后，用vonKossa染色法觀察細(xì)胞在體外形成礦化物沉積的能力。牙髓干細(xì)胞：需多少個指標(biāo)證實牙周膜干細(xì)胞：干細(xì)胞表面標(biāo)記物:多潛能功能－－組織細(xì)胞分化及功能鑒定分化為脂肪細(xì)胞：油紅O染色陽性腫瘤細(xì)胞系的生物學(xué)鑒定腫瘤細(xì)胞系建立后,要對其生物學(xué)性狀進行鑒定,以便日后的研究有可比較的科學(xué)依據(jù)腫瘤細(xì)胞系的基本特性1.細(xì)胞系的來源符合原供體組織的病理學(xué)診斷原供組織的組織病理形態(tài)；動物接種腫瘤組織的組織形態(tài)；2.細(xì)胞系具有腫瘤細(xì)胞的特性:異種體內(nèi)移植致瘤性3.體外無限生存的能力:細(xì)胞系連續(xù)傳代60或80代次。

腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征干系細(xì)胞：每個腫瘤內(nèi)都含有一個或幾個具有相對穩(wěn)定特性的自我保持的（Selfmaintaining）細(xì)胞系。腫瘤的生長就是這些細(xì)胞系的增殖；非干系細(xì)胞：除了干系瘤細(xì)胞，腫瘤還具有失去自我保持能力的細(xì)胞的后代，可稱為“腫瘤的非干系細(xì)胞”。動物腫瘤移植實驗證實，腫瘤結(jié)節(jié)在新宿主身上多次傳代之后仍具有原來腫瘤的主要特征，包括形態(tài)、生化、抗原及細(xì)胞遺傳的標(biāo)志。所有惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的細(xì)胞都具有與親代原發(fā)病損類似的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞特性1．致瘤性：培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞移植到敏感動物后，可獲得形成腫瘤的能力。證明細(xì)胞在體外能經(jīng)過類似于體內(nèi)腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)的變化。動物接種形成的腫瘤應(yīng)進行組織學(xué)、染色體及其它生物學(xué)標(biāo)志的檢查并與原接種細(xì)胞進行比較。致瘤性的判斷移植瘤是判斷細(xì)胞性質(zhì)的關(guān)鍵步驟。首先，移植瘤的組織形態(tài)應(yīng)與原腫瘤組織一致。但有例外，細(xì)胞群體的性質(zhì)可以與植入前不同，因為在植入的細(xì)胞中，只有特殊變異的細(xì)胞具有致瘤性，這些變種可能原來就存在于植入群體內(nèi)，也可能是植入后產(chǎn)生的。在這種情況下可以確認(rèn)接種的致瘤性。影響移植瘤生成的因素（1）植入細(xì)胞與宿主的免疫不相容：如接種的培養(yǎng)細(xì)胞來自純種動物，接種時產(chǎn)生的抗原變化可能會產(chǎn)生致癌的陰性結(jié)果?？梢詫⒓?xì)胞接種到“不受免疫影響”的部位（如眼前房）用射線或免疫抑制劑抑制宿主的免疫反應(yīng)；將細(xì)胞接種到免疫反應(yīng)有先天性遺傳缺陷的動物：（如無胸腺裸小鼠）。目前，多用裸小鼠評價培養(yǎng)細(xì)胞的致瘤性。（2）植入部位，例如，將瘤細(xì)胞接種到小鼠軀干接近頭部位置的皮下，生瘤的陽性率及生長的速度比植到尾部高2－4倍。（3）植入部位微環(huán)境的潛在因素，某些細(xì)胞只有在植入部位找到最佳的微環(huán)境時才形成腫瘤。

生瘤性與細(xì)胞其它性質(zhì)的關(guān)系

細(xì)胞在基質(zhì)上鋪展的面積與生瘤性有關(guān)。微絲束的結(jié)構(gòu)破壞。許多生瘤細(xì)胞系均有大量的微絲束變化，它與形態(tài)轉(zhuǎn)化有關(guān)。停泊依賴性與生瘤性聯(lián)系最密切。在動物體內(nèi)不形成腫瘤的細(xì)胞系，在半固體培養(yǎng)基內(nèi)形成集落的能力也低；與之相反，而大多數(shù)能在動物體內(nèi)生瘤的細(xì)胞系，形成集落的效率也高。2．生長參數(shù)和細(xì)胞行為的變化喪失停泊依賴性（anchoragedependency）一般情況下，原代成纖維及上皮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時不能增殖，它們只有鋪展在固體基質(zhì)上才能增殖。在腫瘤性演化過程中，相當(dāng)一部分的細(xì)胞群體獲得在懸浮狀態(tài)形成集落的能力，并不需貼附在基質(zhì)上。

喪失生長抑制性當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞所需任何一種關(guān)鍵性營養(yǎng)物質(zhì)或生長因子降到閾值以下時,正常細(xì)胞的生長即受到抑制,如異亮氨酸,磷酸鹽,上皮生長因子等。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對一些生長因子需求降低,或失去了對激素和生長因子的需求，在營養(yǎng)不足的情況下可繼續(xù)生長,它們甚至可以殺死一些自身的細(xì)胞,以便在不可能生存的環(huán)境下繼續(xù)生長?；蛘哂捎谀承┺D(zhuǎn)化產(chǎn)生了生長因子類似物,為自身提供了生長因子。密度依賴性抑制正常貼壁性細(xì)胞的增殖率,隨著每單位基質(zhì)面積內(nèi)的細(xì)胞群體的局部密度增加而下降。這一現(xiàn)象稱為密度依賴性抑制(densitydependentinhibition)?；蛏L接觸抑制(contactinhibitionofgrowth),但二者并