第五章第五節(jié)基因克隆技術

第五章第五節(jié)基因克隆技術主講人：吳玉琴其他組員：沈遠志、譚順堅、林敏婷、梁麗歡、何東明在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。5.5基因克隆（clone）技術在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質的子細胞。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。

5.5.1RACE技術(rapidamplificationofcDNAends)

是由Frohman等(1988)發(fā)明的一項技術。是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時間內獲得有利用價值的信息。RACE是基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。一般分5’RACE和3’RACE兩種：

3-RACE較簡單，首先將mRNA或總RNA用PolyT引物反轉錄，根據(jù)一般基因具有polyA尾巴的特點，選用特異引物(根據(jù)已知序列設計)和PolyT引物PCR即可。5-RACE相對較難，目前流行幾種5-RACE。其一為加接頭(傳統(tǒng))，根據(jù)接頭引物和自己設計特異引物PCR，可以設計巢式PCR二次擴增。另外，有利用反向PCR技術，連接成環(huán)再PCR。巢式PCR（nestPCR）：是指利用兩套PCR引物（巢式引物）進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增。由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。一般應用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。5’RACE3’RACE

利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作為一個引物結合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）作為鎖定引物反轉錄合成標準第一鏈cDNA；再用RNase水解模板鏈；然后用一個基因特異引物GSP作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universalprimer）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3'末端的DNA片段擴增出來。RACE的另一種代表方法是自我連接法（Self-Ligationmethod）1、反轉錄（RT）反應2、HybridRNA的分解3、單鏈cDNA的自身連接4、PCR擴增5‘未知區(qū)域5、目的DNA片段的切割回收6、DNA序列測定5.5.2cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板，而僅以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。PCR產物的特異性和所得的cDNA片段純度均高。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴增。5.5.3Gateway大規(guī)?？寺〖夹g