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第五章第五節(jié)基因克隆技術(shù)主講人:吳玉琴其他組員:沈遠(yuǎn)志、譚順堅(jiān)、林敏婷、梁麗歡、何東明在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上,克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子(monozygotictwins)便是屬于同一克隆。5.5基因克?。╟lone)技術(shù)在細(xì)胞水平上,克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞(progenitorcell)分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細(xì)胞。在分子生物學(xué)上,人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中,使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。
5.5.1RACE技術(shù)(rapidamplificationofcDNAends)
是由Frohman等(1988)發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)。是通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù),無須建立cDNA文庫,可以在很短的時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息。RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段,通過往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。一般分5’RACE和3’RACE兩種:
3-RACE較簡單,首先將mRNA或總RNA用PolyT引物反轉(zhuǎn)錄,根據(jù)一般基因具有polyA尾巴的特點(diǎn),選用特異引物(根據(jù)已知序列設(shè)計(jì))和PolyT引物PCR即可。5-RACE相對(duì)較難,目前流行幾種5-RACE。其一為加接頭(傳統(tǒng)),根據(jù)接頭引物和自己設(shè)計(jì)特異引物PCR,可以設(shè)計(jì)巢式PCR二次擴(kuò)增。另外,有利用反向PCR技術(shù),連接成環(huán)再PCR。巢式PCR(nestPCR):是指利用兩套PCR引物(巢式引物)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中,外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物,此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增,從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性(因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少)增加了檢測(cè)的敏感性;又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì),增加了檢測(cè)的可靠性。一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如:病毒,梅毒螺旋體,HIV,腫瘤基因等。5’RACE3’RACE
利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn),以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA;再用RNase水解模板鏈;然后用一個(gè)基因特異引物GSP作為上游引物,用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM(universalprimer)作為下游引物,以cDNA第一鏈為模板,進(jìn)行PCR循環(huán),把目的基因3'末端的DNA片段擴(kuò)增出來。RACE的另一種代表方法是自我連接法(Self-Ligationmethod)1、反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)2、HybridRNA的分解3、單鏈cDNA的自身連接4、PCR擴(kuò)增5‘未知區(qū)域5、目的DNA片段的切割回收6、DNA序列測(cè)定5.5.2cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板,而僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性,通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法,特異性擴(kuò)增目的基因片段。PCR產(chǎn)物的特異性和所得的cDNA片段純度均高。因?yàn)門ester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理,形成平均長度256bp的代表群,保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。5.5.3Gateway大規(guī)??寺〖夹g(shù)
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