大豆根際生防菌對(duì)2種病原菌的防治效果

大豆根際生防菌對(duì)2種病原菌的防治效果

由于富澤細(xì)菌（fusariumspp.）引起的大豆根腐病是一種廣泛發(fā)生、嚴(yán)重影響和難以控制的全球疾病，其中美國(guó)、加拿大、日本和中國(guó)等地發(fā)生了嚴(yán)重病例。在加拿大東部地區(qū)大豆根部分離的主要鐮孢菌為尖鐮孢菌(F.oxysporumcomplex)、茄腐鐮孢菌(F.solanicomplex)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichoides)、三線鐮孢(F.tricinctum)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)和木賊鐮孢菌(F.equsiti)。經(jīng)課題組鑒定尖鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、燕麥鐮孢菌和三線鐮孢菌對(duì)大豆根部均具有很強(qiáng)的致病性。目前輪作是加拿大大部分農(nóng)場(chǎng)主要耕作方式,在加拿大東部地區(qū)大豆主要與禾本科作物輪作,可降低病害的發(fā)生,充分利用土壤資源,持續(xù)提高作物產(chǎn)量。然而鐮孢菌也是引起禾谷類作物根部的主要病原菌,其中澳大利亞、法國(guó)、新西蘭、加拿大、美國(guó)和中國(guó)都有嚴(yán)重發(fā)病的報(bào)道。在不同的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,鐮孢菌的種類、優(yōu)勢(shì)種群和致病性存在很大差異,致使輪作系統(tǒng)中禾谷類作物根部的致病鐮孢菌也給大豆帶來(lái)威脅。該研究分別測(cè)試不同來(lái)源的生防菌株對(duì)尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌引起的根腐病的防治效果及對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響,以篩選抑菌范圍廣、防治效果好、促生作用和定殖能力強(qiáng)的生防菌處理。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1生防菌及菌株病原菌:尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌分離于加拿大渥太華中心試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。生防菌:生防菌株見(jiàn)表1,其中粉紅螺旋聚孢霉ACM941對(duì)菜豆根腐病致病性鐮孢菌有很好的拮抗作用,細(xì)菌菌株SB24課題組已研究證明對(duì)鐮孢菌具有很好的控制效果。1.1.2材料1:牛肉膏PDA培養(yǎng)基:39gPDA試劑溶于1L水中。NA培養(yǎng)基:牛肉浸膏3.0g;蛋白胨10.0g;NaCl5.0g;瓊脂20g;水1000mL;pH7.0。麥粒培養(yǎng)基:麥粒60%含水量浸泡12h滅菌1h后待用。1.1.3大豆品種1.2測(cè)試方法1.2.1鐮孢菌種的制備參照Xue等的方法,大豆種子用10%次氯酸鈉(NaClO)表面消毒1min,用蒸餾水反復(fù)清洗4次,種子平鋪在滅菌吸水紙上再放到培養(yǎng)皿內(nèi),室溫條件下培養(yǎng),每隔12h噴無(wú)菌水,發(fā)芽后待用。將分離出的鐮孢菌分別在PDA培養(yǎng)基中25℃恒溫培養(yǎng)7d,用打孔器打取直徑為2mm的菌片待用。滅菌的吸水紙折疊多層剪成小塊,將吸水紙用無(wú)菌水浸透,把發(fā)芽48h的種子置于滅菌紙中央,挑取培養(yǎng)好的鐮孢菌菌片接種到萌發(fā)種子的根毛區(qū)。接種后的植株放在雙層滅菌紙中折起,然后用鋁箔紙包裹起來(lái)。底部浸在蒸餾水中以便種子吸水,頂端打開(kāi)利于植物生長(zhǎng)。將包好的鋁箔紙放在小的淺盤(pán)里,然后將其置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d。每天檢測(cè)吸水紙中的含水量,按需水量加水。1.2.2病原菌抗菌劑的制備研究測(cè)試12個(gè)真菌菌株(HJ-ZT2、CH-Tr51、HJ-MM35、CH-Tr14、HJ-ZT1、CH-Tr18、HJ-MM8、CH-Tr9、HJ-MM7、CH-Tr12、HJ-MM9、ACM941)對(duì)2株病原菌的拮抗能力,從生長(zhǎng)7d的病原菌菌落邊緣打取直徑5mm菌餅,放在PDA平板的一側(cè),同樣大小的生防菌菌餅放于相距7.5cm處。對(duì)照只接尖鐮孢菌。25℃黑暗培養(yǎng)7d,每個(gè)處理4次重復(fù),2次重復(fù)試驗(yàn)。計(jì)算抑制率I=R1/R2(R1為對(duì)峙培養(yǎng)皿中尖鐮孢菌面對(duì)生防菌所生長(zhǎng)的距離、R2為對(duì)照皿中尖鐮孢菌生長(zhǎng)的距離)。1.2.3生防真菌制劑的制備菌種擴(kuò)繁:量取一定量的麥粒放在容器中,用水反復(fù)清洗干凈,加入足夠量的水浸泡12h。濾出水后在121℃的滅菌鍋里滅菌60min,冷卻后將PDA上培養(yǎng)的鐮孢菌接種到麥粒培養(yǎng)基中,在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d即可接種使用。生防菌劑制備:PDA平皿上活化的生防真菌培養(yǎng)7d,用無(wú)菌水依次稀釋配制成107cfu·mL-1孢子懸浮液,將配制好的菌懸液與褐煤載體按1∶10的比例配成生防真菌制劑,再將生防真菌制劑和大豆種子按1∶10的質(zhì)量比進(jìn)行拌種,自然風(fēng)干后待用。生防細(xì)菌菌劑的制備是將細(xì)菌用NA培養(yǎng)基活化2d,后將其接入液體NA培養(yǎng)基,25℃搖瓶培養(yǎng)2d,其它方法同真菌。盆栽試驗(yàn):試驗(yàn)設(shè)計(jì)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),共設(shè)16個(gè)生防處理,單菌制劑為HJ-ZT2、CH-Tr51、HJ-MM35、CH-Tr14、HJ-ZT1、CH-Tr18、HJ-MM8、CH-Tr9、HJ-MM7、CH-Tr12、HJ-MM9、ACM941、復(fù)配菌劑為ACM941+HJ-MM7、SB24+ACM941和SB24+HJ-MM7,設(shè)分別只接尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌為對(duì)照、Vitaflo280藥劑拌種為化學(xué)對(duì)照,每個(gè)處理4次重復(fù)。生防菌劑按土壤質(zhì)量的5%接種到土壤中,混合均勻后播入已消毒的大豆種子8粒,25℃晝夜交替溫室條件培養(yǎng),30d后調(diào)查株高、鮮重和發(fā)病情況,發(fā)病情況的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照陳宗澤等,2次重復(fù)試驗(yàn)。1.2.4生防菌試驗(yàn)及接種量試驗(yàn)試驗(yàn)于2008年在加拿大禾谷類和油料作物研究所中心試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行,土壤分別接種尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌,鐮孢菌菌劑的接種量是100g·m-2。生防菌處理和接種方式與溫室試驗(yàn)相同。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每個(gè)處理4次重復(fù),30d后調(diào)查出苗率,收獲期調(diào)查病害嚴(yán)重度、株高、各產(chǎn)量性狀及大豆產(chǎn)量。各指標(biāo)較對(duì)照增加值計(jì)算均為:(處理-對(duì)照)/對(duì)照。1.2.5統(tǒng)計(jì)分析2結(jié)果與分析2.1芽孢桿菌的致病性尖鐮孢菌使大豆根部產(chǎn)生大面積黑色病斑甚至整個(gè)根部壞死。禾谷鐮孢菌的致病性從癥狀看要輕于尖鐮孢菌,它在根部形成黑色或紅色病斑,根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)不會(huì)受到抑制且有些植株發(fā)病癥狀很輕。該試驗(yàn)中對(duì)照在PDA培養(yǎng)基接觸的根部,顏色變暗,但與病斑有很大區(qū)別。2.2ch-tr18的抑菌效果實(shí)驗(yàn)室控制條件下生防菌株對(duì)尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的拮抗效果差異不顯著(P<0.05),但不同生防菌的抑菌率差異顯著(P>0.05)。合并分析可知:HJ-ZT1、HJ-MM7、HJ-ZT2、CH-Tr14、HJ-MM8和CH-Tr18的抑菌率分別為70.4%、66.45%、68.27%、66.72%、64.53%和64.02%,顯著高于CH-Tr51、HJ-MM35、HJ-MM9和ACM941(圖2)。其中HJ-ZT1、HJ-MM7和HJ-ZT2生長(zhǎng)速度較快,在與禾谷鐮孢菌和尖鐮孢菌的對(duì)峙試驗(yàn)中HJ-ZT1和HJ-ZT2菌絲密集且將禾谷鐮孢菌菌絲覆蓋繼續(xù)生長(zhǎng),禾谷鐮孢菌菌絲被溶解而變得稀疏;HJ-MM7在交界處菌絲停止生長(zhǎng),孢子密集出現(xiàn)明顯的抑菌帶,鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制。ACM941在平板試驗(yàn)中生長(zhǎng)速度較慢看不出對(duì)鐮孢菌的拮抗作用,而Xue等研究表明其在田間應(yīng)用具有良好的抑菌效果,因此需進(jìn)一步測(cè)試其抑菌能力。2.3生防菌對(duì)禾谷鐮孢菌的防治效果溫室條件生防菌處理對(duì)尖鐮孢菌和谷鐮孢菌的防效及促生作用均存在差異(表2)。CH-Tr12對(duì)尖鐮孢菌防治效果最好為72%,與ACM941、SB24+HJ-MM7和化學(xué)對(duì)照的防效差異不顯著。菌株HJ-MM35、CH-Tr12、ACM+HJ-MM7、SB24+ACM941、CH-Tr18和CH-Tr9可在很大程度上促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。生防菌CH-Tr14、HJ-MM7和CH-Tr12對(duì)禾谷鐮孢菌防治效果較好,防效分別為37%38%、36%和36%,顯著高于HJ-ZT2和HJ-MM8;且與其它處理差異不顯著?；瘜W(xué)對(duì)照處理的大豆出苗率顯著高于其它處理,復(fù)配后的生防菌處理ACM941+HJ-MM7和SB24+ACM941可以使出苗率提高21%和23%。且CH-Tr18、CH-Tr9、ACM941和SB24+ACM941處理均較大程度的提高植株的根長(zhǎng)、株高、根干重和地上部干重。2.4苯二氮素及其應(yīng)用穩(wěn)定性表1由表3可知,田間土壤接種病原菌條件下生防菌對(duì)尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌引起的大豆根腐病防治效果差異不顯著(P<0.05)。合并分析可知ACM941+HJ-MM7使大豆增產(chǎn)10%,顯著高于ACM941和CH-Tr51。其中CH-Tr14增產(chǎn)9%,CH-Tr12為8%,CH-Tr18和化學(xué)藥劑均增產(chǎn)6%。這表明化學(xué)藥劑在苗期防治效果較好,但田間持效性差,而生防制劑持效性長(zhǎng),田間產(chǎn)量增加幅度大。HJ-MM7、CH-Tr12、HJ-MM9和SB24+HJ-MM7使出苗率有所降低,但均可提高大豆產(chǎn)量,可能由于出苗率相對(duì)較低的大豆在空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)上占優(yōu)勢(shì),同時(shí)生防菌在后期大量繁殖對(duì)植株具有一定的保護(hù)作用,從而促使植株生長(zhǎng)旺盛表現(xiàn)出增產(chǎn)效果。3討論3.1生防菌株協(xié)同保鮮目前大豆根腐病生防菌株主要分離于大豆根部及根際土壤,該研究在輪作系統(tǒng)中分離于小麥根部及根際土壤的生防菌株對(duì)大豆根部致病性尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌均有抑制作用,因此輪作系統(tǒng)中不同作物根際生防菌株均可進(jìn)行生物防治研究,這拓寬了生防菌株的采集范圍。大豆根腐病是多種病原菌復(fù)合侵染,生防菌復(fù)配在一定栽培條件下更能適應(yīng)不同的土壤、多種病原菌和環(huán)境變化,從而減輕病害發(fā)生程度,促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育。利用復(fù)配菌株處理不是簡(jiǎn)單的累加,而有一定的協(xié)同作用,充分發(fā)揮不同菌株的生防機(jī)制,起到防病增產(chǎn)的作用。來(lái)源于不同植物根際的生防菌復(fù)配,也可有效防治輪作系統(tǒng)中相同病原菌引起的病害。3.2對(duì)大豆生防菌的控制生防菌在不同試驗(yàn)條件下對(duì)2種鐮孢菌的防治效果存在差異。平板拮抗試驗(yàn)中2種鐮孢菌生長(zhǎng)速度相近,生防菌對(duì)2種鐮孢菌表現(xiàn)的拮抗能力差異不顯著。溫室盆栽條件,生防菌對(duì)尖鐮孢菌的防治效果要高于禾谷鐮孢菌,這是由于尖鐮孢菌的致病性較強(qiáng),在相同接種劑量的溫室條件尖鐮孢菌引起大豆根腐病發(fā)病重,因此生防菌防治效果明顯,這與目前研究結(jié)果一致。田間接種試驗(yàn)是在復(fù)雜的土壤條件下進(jìn)行,多年大豆田間分離病原菌結(jié)果可知尖鐮孢菌的分離頻率明顯高于禾谷鐮孢菌,接種病原菌后尖鐮孢菌仍為優(yōu)勢(shì)種群,因此生防菌處理對(duì)2種鐮孢菌的防治和增產(chǎn)效果