黑曲霉發(fā)酵酸性果膠酶生產(chǎn)蘋果汁的研究

黑曲霉發(fā)酵酸性果膠酶生產(chǎn)蘋果汁的研究

果實凝膠酶是指能夠配合分解植物組織中的果實凝膠酶的總稱，可分為兩類：解聚酶（deoxykome）和果膠酶（perciner）。酸性果膠酶一般指內(nèi)聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase,EC3.2.1.15),通過水解作用方式無規(guī)則切斷果膠酸分子的α-1,4糖苷鍵,將其降解成寡聚半乳糖醛酸和少量半乳糖醛酸,目前主要應(yīng)用于食品工業(yè)的果蔬汁和果酒澄清、桔子脫囊衣、低糖果凍生產(chǎn),麻料脫膠,木材防腐和飼料工業(yè)等。堿性果膠酶一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonatelyase,EC4.2.2.1～2),通過反式消去作用方式裂解果膠酸分子的α-1,4糖苷鍵,其主要應(yīng)用于植物病毒的純化、紙漿漂白和棉織物處理等。本研究室選育了1株高產(chǎn)酸性果膠酶的黑曲霉LLW-1菌株(另文報道)。文中報道了LLW-1菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件試驗結(jié)果以及利用果膠酶澄清蘋果汁的工藝條件試驗結(jié)果。1材料和方法1.1生產(chǎn)蘑菇黑曲霉(Aspergillusniger)LLW-1酸性果膠酶高產(chǎn)菌株,江南大學(xué)醫(yī)學(xué)系分子生物學(xué)研究室選育和保藏。1.2果膠、半乳糖醛酸麩皮、豆餅粉和玉米漿,無錫市恒盛生物技術(shù)有限公司;食用果膠,Danisco公司;試劑級果膠和半乳糖醛酸,Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3培養(yǎng)基和培訓(xùn)方法1.3.1固體培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基,用于菌種的活化和保藏等。1.3.2樣品表面的分離在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中添加1.5g/L去氧膽酸鈉,以限制絲狀真菌在平皿上擴散生長,便于單菌落的分離和挑選。1.3.3菌種zea250mL三角瓶裝10g基料(麩皮),(NH4)2SO410g/kg,KH2PO43.0g/kg,CaCl21.0g/kg,MgSO4·7H2O1.0g/kg(均相對于基料),料水比1∶1.0,自然pH;121℃滅菌30min;接種一菌耳斜面活化種子,30℃靜置培養(yǎng)96h,期間約28h翻曲1次。對于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗,30℃培養(yǎng)72h,24h翻曲1次。1.4果實酶活性測定dns法參照文獻(xiàn)的方法并作相應(yīng)改動。1.4.1研磨法na2稱取成熟固態(tài)發(fā)酵曲1.0g,加29mLNa2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH3.5),于研缽中充分研磨,40℃浸提30min,濾紙過濾,濾液再經(jīng)適當(dāng)稀釋,待測定。1.4.2還原糖的檢測吸取0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液,加至2.4mL用pH3.5、Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制的5.0g/L果膠(Sigma)溶液中,50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min;采用DNS法測定酶水解產(chǎn)生的還原糖。以每分鐘水解果膠產(chǎn)生1μmol還原糖(以半乳糖醛酸計)的酶量定義為1個果膠酶活力國際單位(IU)。1.5酶解澄清實驗用水把蘋果洗凈(市售紅富士),去核,切成碎塊,浸泡于1.0g/L的抗壞血酸溶液中,取出瀝干,用搗碎機打成果漿,迅速于沸水浴中處理5～10min滅酶,紗布過濾,取濾汁20mL分裝于25mL具塞刻度試管中,加入不等量的果膠酶和其他助劑,于不同溫度下酶解澄清一定時間,待測定。1.6蘋果果汁澄清測定1.6.1澄清度將酶處理的果汁定時取出,于沸水浴中處理5min終止反應(yīng),濾紙過濾,用722型分光光度計在660nm處以蒸餾水為參比,測定濾液透光度,即為澄清度的百分?jǐn)?shù)。1.6.2過濾率測定將20mL酶處理的果汁用濾紙過濾,記錄過濾至10mL濾液所需時間,換算成單位時間內(nèi)的濾液體積(mL/min),即為過濾速率。1.6.3果膠降解量測定參照文獻(xiàn)的方法并略作改動。吸取2mL經(jīng)過酶處理的果汁濾液,加入4mL酸性乙醇(含10mL/L濃HCl),混勻,20min后用分光光度計在660nm處以酸性乙醇為參比,測定透光度,定義為果膠降解量的百分?jǐn)?shù)。2結(jié)果與討論2.1豬產(chǎn)酶培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化試驗包括豬產(chǎn)酶培養(yǎng)基的單個因素2.1.1豆餅粉與麩皮不同質(zhì)量比對產(chǎn)果膠酶的影響在麩曲種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,用豆餅粉替換部分麩皮以補充有機氮源,其余成分不變,試驗了豆餅粉與麩皮不同質(zhì)量比對菌株產(chǎn)果膠酶的影響(表1)。由表1可見,果膠酶活力隨豆餅粉與麩皮質(zhì)量比的升高而提高,當(dāng)m(豆餅粉)∶m(麩皮)=2∶8時,菌株產(chǎn)酶量最高,達(dá)1128IU/g(干曲)。2.1.2料水比對產(chǎn)果膠酶菌株產(chǎn)果膠酶活性的影響將種子培養(yǎng)基中的基料(豆餅粉+麩皮)質(zhì)量比改為2∶8,其余成分不變,試驗了不同料水比對菌株產(chǎn)果膠酶的影響(表2)。由表2可見,最適料水比為1∶1.2。在實驗中發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基含水量過高時,曲料易結(jié)塊成團,菌絲體只在團塊表面生長,發(fā)酵不均勻,而影響菌株產(chǎn)酶。2.1.3玉米漿與玉米膠酶的相互作用在已確定的較佳培養(yǎng)基組成[m豆餅粉)∶m(麩皮)=2∶8,料水比1∶1.2]基礎(chǔ)上,又試驗了添加果膠和玉米漿對菌株產(chǎn)果膠酶的影響(表3)。表3的結(jié)果表明,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加玉米漿對菌株產(chǎn)果膠酶有促進作用,用量為0.5mL/10g(基料)時,產(chǎn)酶量最高。玉米漿中含有促生長因子、微量元素,對菌株的生長和產(chǎn)酶有促進作用。果膠酶屬于誘導(dǎo)酶,一般認(rèn)為,基質(zhì)中含有的果膠或聚半乳糖醛酸對產(chǎn)酶起著誘導(dǎo)的作用,但本試驗結(jié)果表明,向培養(yǎng)基中添加食用果膠,對該菌株產(chǎn)酶量影響不大,且增加了培養(yǎng)基的粘度和發(fā)酵成本,所以添加果膠對果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)意義不大。2.1.4無機氮源添加量對菌株產(chǎn)果膠酶的影響在已確定的發(fā)酵培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上,又試驗了(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3三種無機氮源不同添加量對菌株產(chǎn)果膠酶的影響(表4)。結(jié)果表明,在已用豆餅粉做有機氮源的前提下,再添加無機銨鹽可進一步提高產(chǎn)酶量,其中添加20g/kg(NH4)2SO4的產(chǎn)酶量最高,達(dá)1747IU/g(干曲)。2.1.5表面活性劑對酶促進劑產(chǎn)酶的影響試驗了表面活性劑Tween-80不同添加量對菌株產(chǎn)果膠酶的影響(表5)。由表5可見,添加1.5g/kg的Tween-80對產(chǎn)酶有顯著促進作用。某些特定表面活性劑能提高酶的產(chǎn)量,其作用機理目前尚不清楚,但一般認(rèn)為可能是由于以下原因所致:(1)表面活性劑能改變細(xì)胞膜的通透性,使細(xì)胞內(nèi)的酶更易透過細(xì)胞膜而分泌出來,但細(xì)胞內(nèi)酶的數(shù)量總是趨于恒定不變。因此,細(xì)胞內(nèi)的酶將隨著不斷向外分泌而不斷合成,細(xì)胞外培養(yǎng)基中的酶則不斷積累,從而提高了酶的產(chǎn)量。(2)某些表面活性劑能提高酶的穩(wěn)定性或?qū)γ赣屑せ钭饔谩?.2角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取影響菌株產(chǎn)酶活力較大的培養(yǎng)基組分:豆餅-麩皮、(NH4)2SO4和Tween-80三個因素,利用正交試驗表L9(34)進行三因素三水平正交試驗(表6),以進一步優(yōu)化三角瓶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。表6試驗數(shù)據(jù)及處理結(jié)果表明,m(豆餅)∶m(麩皮)的極差R=636為最大,Tween-80的極差R=262為最小。從k值分別取其數(shù)值最大的參數(shù),可獲得三角瓶固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:250mL三角瓶裝10g基料,[m(豆餅)∶m(麩皮)=2.0g∶8.0g)],(NH4)2SO420g/kg,Tween-801.5g/kg,玉米漿50mL/kg,KH2PO43.0g/kg,CaCl21.0g/kg,MgSO4·7H2O1.0g/kg(均相對于基料),料水比1∶1.2,自然pH。2.3果膠酶活力測定選取28、31和34℃三個不同溫度分別對YL-1菌株進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗,36h起每隔12h取樣測定酶活力(圖1)。由圖1可見,31℃培養(yǎng)72h果膠酶活力最高,達(dá)2418IU/g(干曲);發(fā)酵溫度28℃時,微生物生長較緩慢,發(fā)酵周期延長;而發(fā)酵溫度過高時,菌絲體過早衰老,產(chǎn)酶周期短。2.4果膠酶對蘋果汁澄清效果的影響2.4.1明膠添加量的確定試驗了明膠不同添加量對果汁澄清效果的影響(表7)。由表7可見,澄清度、過濾速率和果膠降解量隨明膠添加量的增加而增加,當(dāng)明膠添加量超過0.05g/L,各種參數(shù)的增加已不明顯,因此在本試驗條件下取明膠用量0.05g/L。加入明膠能形成明膠-單寧沉淀物,通常0.05～0.1g/L的明膠對果汁的澄清已很充分。2.4.2蘋果汁澄清效果的比較將蘋果汁(自然pH4.15)分別用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至不同的pH值,試驗了不同pH值對果汁澄清效果的影響(表8)。由表8可見,在pH2.5～4.0范圍內(nèi),果膠酶均能有效地發(fā)揮其澄清果汁的作用。蘋果汁根據(jù)蘋果成熟度的不同,其自然pH一般在3.2～4.5范圍內(nèi)變化,幾乎在酶的有效作用范圍內(nèi)。因此澄清過程中無需調(diào)節(jié)蘋果汁pH值,而且在實際生產(chǎn)中也不宜用酸堿調(diào)節(jié)pH值。2.4.3超聲溫度對蘋果汁品質(zhì)的影響試驗了不同酶解溫度對果汁澄清效果的影響(表9)。表9結(jié)果表明,在不使酶失活的溫度范圍內(nèi),蘋果汁的澄清度和果膠降解量隨溫度的升高而增加,但溫度過高將產(chǎn)生后熟味,嚴(yán)重影響蘋果汁的風(fēng)味和品質(zhì)。因此酶促果汁澄清的溫度一般以45℃為宜,若要加快果汁澄清,可適當(dāng)提高酶濃度或溫度。2.4.4果汁澄清度和溫度的確定于不同溫度(30℃和45℃)和酶解時間(1h)條件下,試驗了不同酶濃度和溫度對果汁澄清效果的影響(表10)。由表10可見,(1)為了達(dá)到一定的澄清度,溫度越低,所需酶濃度越高;(2)在相同溫度條件下,果汁澄清度隨酶濃度增加而增加。綜合各種因素選取45℃、酶濃度500IU/L。3黑曲霉llw-1的制備工藝(1)經(jīng)一系列的三角瓶固態(tài)發(fā)酵單因素試驗和正交試驗,LLW-1菌株固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:250mL三角瓶裝10g基料[m(豆餅)∶m(麩皮)=2.0g∶8.0g)],(NH4)2SO420g/kg,Tween-801.5g/kg,玉米漿50mL/kg,KH2PO43.0g/kg