基因診斷和基因治療-

基因診斷和基因治療南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室沈勤概念：

基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列。基因的改變，會(huì)導(dǎo)致各種表型的改變，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生。將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng)稱為基因病?；虿》譃槿箢悾阂弧位虿。河蓡蝹€(gè)基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因?。河啥鄠€(gè)基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動(dòng)脈硬化、糖尿病、先天畸形等、三、獲得性基因?。褐竿庠椿颍―NA）侵入，在機(jī)體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。第一節(jié)基因診斷（DNAdiagnosis）一、基因診斷的概念和基本概況臨床診斷生化學(xué)診斷免疫學(xué)診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。（細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識(shí)別差異等）基因診斷對(duì)患者基因直接分析基因診斷定義（概念）：

基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷或輔助診斷?；蛟\斷是在DNA/RNA水平檢測分析基因的存在、結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點(diǎn)：基因診斷的特點(diǎn)：1、病因診斷：直接瞄準(zhǔn)病理基因，不僅對(duì)表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，如:確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強(qiáng)、靈敏度高：選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴(kuò)增PCR技術(shù)。3、穩(wěn)定性高4、診斷范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。樣品可長期保存?？蓹z測正在生長的病原體或潛在病原體。（與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的診斷技術(shù)相比）基因診斷的基本概況：伴隨分子生物學(xué)理論技術(shù)的發(fā)展而建立和發(fā)展。DNA雙螺旋遺傳密碼破譯DNA重組癌基因與抑癌基因研究地中海貧血病基因治療和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開發(fā)PCR、分子雜交等一系列技術(shù)發(fā)展二、基因診斷的對(duì)象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學(xué)方法、基因診斷等。尤其是當(dāng)無抗體時(shí)，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病:發(fā)病的原因?yàn)樘囟ɑ虻耐蛔?。腫瘤的發(fā)生：發(fā)病機(jī)理尚不請(qǐng)。

初步認(rèn)為是個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的細(xì)胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病二、基因診斷的對(duì)象（1）用核心順序的串聯(lián)重復(fù)序列組成探針進(jìn)行雜交研究，可同時(shí)檢出具有高度多態(tài)性位點(diǎn)。（2）用southern雜交得到DNA指紋圖譜個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、法醫(yī)物證4、其他二、基因診斷的對(duì)象遺傳穩(wěn)定，個(gè)體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定?；蛟\斷的基本策略：1、檢測已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時(shí)的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細(xì)菌、霉菌和寄生蟲的基因、與致病有關(guān)的癌基因、抗癌基因、

地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。2、檢測與某種遺傳標(biāo)志連鎖的致病基因遺傳連鎖－－同一染色體相鄰的二個(gè)或二個(gè)以上的基因或限制性酶切位點(diǎn)，由于位置十分靠近，在遺傳時(shí)分離幾率很低，常一起遺傳稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖－－用限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)作遺傳標(biāo)志，定位與之相連鎖的正?；蚺c致病基因，建立相應(yīng)的遺傳連鎖圖譜。定位性克?。鶕?jù)遺傳連鎖圖進(jìn)行定位性克隆。比較正常和異常基因的差別，可找出導(dǎo)致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆策略是當(dāng)前基因診斷的重要基礎(chǔ)。3、檢測表型克隆基因針對(duì)多基因?。ㄈ纾褐囟确逝帧⑾?、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾?。１硇涂寺〖夹g(shù)－－是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接分離該表型的相關(guān)基因，并對(duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。該策略既不需預(yù)先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數(shù)目及其相互作用方式的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異?；蚪M尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯(cuò)配篩選技術(shù)：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷基因診斷的基本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸（PCR提高靈敏度)2、制備和標(biāo)記核酸探針3、基因檢測分析三、基因診斷的常用技術(shù)核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）限制性片段長度多態(tài)性（RELP）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）等位基因特異的寡核苷酸（ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）基因芯片1、核酸分子雜交原理：利用核酸的變性、復(fù)性及堿基互補(bǔ)的性質(zhì)，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測核酸樣品中是否存在與探針互補(bǔ)的同源核酸序列，進(jìn)行DNA或RNA定性定量分析?；驒z驗(yàn)的兩個(gè)必要條件：1、必需的特異探針（標(biāo)記的）2、必需的基因組DNA核酸分子雜交－－核酸印跡雜交DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Nouthernblot）斑點(diǎn)印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)核酸印跡雜交基本過程：提取DNA或RNA→酶切→凝膠電泳→膠變

性處理（DNA）→轉(zhuǎn)印核酸片段到NC膜上。

（RNA可直接用變性膠電泳，轉(zhuǎn)膜）1、制備樣品：核酸印跡雜交基本過程：（2）制備探針：探針：一段能和待檢測核酸分子按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則而結(jié)合的核酸分子片段。探針需要標(biāo)記可直接檢測的元素或分子。

如：同位素、熒光、生物素等核酸印跡雜交基本過程：核酸印跡雜交可檢測pg水平的靶分子（4）檢測：方法依標(biāo)記的探針而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*熒光素（3）雜交：預(yù)雜交－－封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)雜交－－探針與核酸分子結(jié)合核酸印跡雜交基本過程：2、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)原理：以待擴(kuò)增DNA為模板，在互補(bǔ)模板兩端序列的寡核苷酸引物介導(dǎo)下，通過耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保留復(fù)制機(jī)制延模板鏈延伸，快速、特異地?cái)U(kuò)增特定的DNA。一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。（無細(xì)胞分子克隆技術(shù)）。耐高溫DNA聚合酶－－－Taq酶寡核苷酸引物：設(shè)計(jì)引物和確定退火溫度是PCR成功的關(guān)鍵。PCR的基本過程：（循環(huán)程序）變性（95℃）→退火（55℃－65℃）→延伸（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水棲高溫菌，最適反應(yīng)溫度為72℃，且經(jīng)90℃以上加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性。（呈2n擴(kuò)增速度）PCR基本過程和原理特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高樣品可以是：毛發(fā)、血痕單細(xì)胞、病原體、腫瘤殘留物、犯罪現(xiàn)場遺留物基因診斷中常用的PCR技術(shù)：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA為模板，擴(kuò)增特定核苷酸序列。用于檢測特定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。以總RNA或mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后擴(kuò)增。用于檢測特定基因表達(dá)水平的主要方法之一。（3）、PCR-SSCP：檢測基因未知突變的常用技術(shù)。簡單、快捷、靈敏。（4）、多重PCR：指在一次PCR反應(yīng)中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增DNA序列上不同序列片段的一種PCR技術(shù)。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位PCR：直接用組織切片和細(xì)胞進(jìn)行PCR或RT-PCR，在組織、細(xì)胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特點(diǎn)基因序列。（6）、實(shí)時(shí)定量PCR：借助特異性結(jié)合DNA的熒光染料，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測PCR擴(kuò)增的DNA量的變化。其他重要的PCR衍生技術(shù)反向PCR（IPCR）標(biāo)記引物PCR（labelledprimersPCR）錨定PCR（anchoredPCR）差異展示PCR（DD-PCR）（見書“分子生物學(xué)技術(shù)”章節(jié)）3、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）檢出方法：Southern印跡概念：用同一限制性內(nèi)切酶完全切割同一物種的不同個(gè)體的基因組DNA，出現(xiàn)分子質(zhì)量不同的同源片段，這種由限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段差異，稱限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。人類基因組中由中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸的差異稱－－DNA多態(tài)性RFLP類型：2、由于鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入和重排導(dǎo)致DNA順序的變化，因而酶切片段改變－－－序列多態(tài)性。1、單個(gè)堿基的突變引起酶切位點(diǎn)的變化－－－點(diǎn)多態(tài)性致病基因附近或內(nèi)部一般存在RFLP,可用于連鎖分析的基因診斷。（四）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）應(yīng)用于基因突變性質(zhì)不明的連鎖分析。AFLP－－串聯(lián)重復(fù)的短片段的長度多態(tài)性通過PCR擴(kuò)增,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后電泳,產(chǎn)生顯示擴(kuò)增片段多態(tài)性。AFLP原理：首先利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對(duì)象的基因組序列，產(chǎn)生不同長度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板。為達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸（1～3個(gè)）的不同引物，然后PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對(duì)的酶切片段被擴(kuò)增。最后將被擴(kuò)增的片段在高分辨率的測序凝膠上電泳，這樣其多態(tài)性即根據(jù)擴(kuò)增片段的長度與數(shù)量的不同而被分開。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即等位片段之間差別只有幾個(gè)bp。5、等位基因特異的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成兩種探針：①已知突變位點(diǎn)的核苷酸序列（M）

②正?；驂A基序列（N）2、雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果：M+N-受檢者是突變基因的純合子M-N+受檢者是不存在突變基因M-N-受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類型M+N+受檢者是突變基因的雜合子原理：

已知基因突變部位和性質(zhì)，合成基因特異的核苷酸探針（20bp），標(biāo)記后與受檢者DNA雜交診斷。（可與PCR聯(lián)用：PCR-ASO）6、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開.PCR-SSCPPCR-SSCP基本過程①PCR擴(kuò)增靶DNA②將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后快速復(fù)性;③將單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;④通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.7、基因芯片將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。基本原理：（生物集成模片、DNA陣列、或寡核苷酸微芯片）基因芯片技術(shù)：目的：檢測外源性基因的侵入目標(biāo)：1、微生物2、病毒如：HIV（致艾滋病AIDS）3、寄生蟲、4、不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌）5、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原體（克立氏體）四、基因診斷的臨床應(yīng)用:1、在感染性疾病檢測中應(yīng)用艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細(xì)胞（CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會(huì)性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。HIV感染后，95%感染者5個(gè)月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測。艾滋病與HIV病毒檢測技術(shù)：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的設(shè)計(jì)：應(yīng)在保守區(qū)（基因：pol,env,gag,tat)病毒特點(diǎn)：HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k/RNA，主要基因結(jié)構(gòu)和組成形成與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，但較之復(fù)雜，故稱復(fù)雜反轉(zhuǎn)錄病毒HIV屬反轉(zhuǎn)錄病毒－－－即單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體。非典型性肺炎（SARS）由一種新型冠狀病毒（SARS-CoV）引起，多種途徑傳播，傳染性強(qiáng)、高致死率的急性疾病。診斷依靠：流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、放射診斷、血清學(xué)（熒光免疫、ELISA）PCR作為一種靈敏的早期病原學(xué)診斷必不可少（關(guān)鍵是引物的合成）2、在遺傳病檢測中的應(yīng)用產(chǎn)前診斷檢測妊娠8－12周的絨毛DNA或羊水細(xì)胞

PCR診斷一系列遺傳疾病鐮刀狀細(xì)胞貧血的診斷方法：－RFLP診斷

MstⅡ酶切識(shí)別序列：CCTNAGG

切割正常β鏈序列：CCTGAGG

不切割突變序列：CCTGTGG

－ASO探針診斷3、在腫瘤檢測中的應(yīng)用原癌基因生物正常細(xì)胞基因中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的癌基因抑癌基因一類抑制細(xì)胞增殖的基因，其失活可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長處于平衡狀態(tài)。癌基因激活變化及檢測：1、基因擴(kuò)增：即染色體某區(qū)段基因拷貝數(shù)增加，或癌基因的擴(kuò)增。檢測方法：Southern雜交定量PCR2、基因的過量表達(dá)：包括基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的過量表達(dá)及非DNA水平的過量表達(dá)。檢測方法：Northern雜交RT-PCR3、點(diǎn)突變：檢測方法為各種基于PCR的方法。抑癌基因的檢測：SouthernPCR大片段的缺失、和點(diǎn)突變*兩個(gè)等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢出兩個(gè)等位抑癌基因。方法：RFLP結(jié)合PCR，進(jìn)行缺失檢測

點(diǎn)突變主要采用PCR腫瘤標(biāo)志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。（1）酶類腫瘤標(biāo)志物（2）激素類標(biāo)志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白標(biāo)志物（5）糖蛋白類抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸酰基轉(zhuǎn)移酶（8）多胺免疫組化篩選提高檢出率法醫(yī)學(xué)鑒定針對(duì)人類DNA遺傳差異進(jìn)行的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。常用技術(shù):DNA指紋分析（VNTR）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）遺傳特征分析PCR-擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技術(shù)根據(jù)可變串聯(lián)重復(fù)序列（小衛(wèi)星DNA）多態(tài)性

高度的個(gè)體特異性DNA指紋（圖譜）分析：⑴、選擇核心序列作探針，選在核心序列上無切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，酶解樣品，Southernblot得到DNA指紋圖譜。針對(duì)可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）（VNTR是判斷個(gè)體的遺傳標(biāo)志）⑵、針對(duì)VNTR側(cè)翼保守區(qū)序列設(shè)計(jì)探針，用PCR對(duì)該區(qū)擴(kuò)增，電泳得到個(gè)體之間長度不同的條帶圖譜。（VNTR片段較長PCR不易擴(kuò)增）。第二節(jié)基因治療（genetherapuy)概念：將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因缺陷和異常基因引起的疾病，達(dá)到治療目的。導(dǎo)入的基因可以與缺陷基因?qū)?yīng)、在體內(nèi)表達(dá)具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關(guān)的治療基因。概念的擴(kuò)展：凡是采用分子生物學(xué)方法原理，將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，達(dá)到治療目的的方法，都可稱為基因治療?；蛑委煵呗?總原則：－－直接補(bǔ)替缺陷基因－－抑制非正?；虍a(chǎn)物表達(dá)－－間接調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力。－－利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特異性殺傷1、基因矯正－－將致病基因的堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。2、基因置換－－用正?；蛲ㄟ^體內(nèi)基因同源重組，原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常3、基因增補(bǔ)－－將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞