MMM 第二代測(cè)序技術(shù)

第二代高通量測(cè)序技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展測(cè)定PCR產(chǎn)物或DNA克隆片段的精確核苷酸序列。一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理

加入特殊核苷酸底物——雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），與普通dNTP不同，在脫氧核糖的3’位置缺少一個(gè)羥基，不能形成磷酸二酯鍵。例如，存在ddCTP、和四種dNTP（其中一種為α-32P標(biāo)記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成以ddC殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長(zhǎng)度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來(lái)。采用類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時(shí)制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結(jié)尾的三組長(zhǎng)短不一的片段。將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長(zhǎng)的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。AGCTAGCTAGCT

AGCTAGCTAGCT循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中的同一反應(yīng)管內(nèi)，四色熒光標(biāo)記的四種ddNTPs與未標(biāo)記的四種正常dNTPs竟?fàn)幮缘負(fù)饺氲秸谘由斓腄NA鏈末端，經(jīng)過(guò)30個(gè)左右的循環(huán)測(cè)序反應(yīng)后，就可隨機(jī)但又特異地?cái)U(kuò)增到不同長(zhǎng)度的DNA片段；測(cè)序儀的專用激光掃描鏡頭實(shí)時(shí)掃描不同大小的DNA片段在相應(yīng)時(shí)間通過(guò)垂直電泳膠讀數(shù)區(qū)時(shí)發(fā)射的熒光，將不同大小DNA片段發(fā)射的熒光實(shí)時(shí)地傳遞給計(jì)算機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)收集軟件，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換成膠圖文件及原始數(shù)據(jù)信號(hào)。當(dāng)電泳完畢后，DNA序列分析軟件通過(guò)分析膠圖文件及原始數(shù)據(jù)信號(hào)，得到最終的測(cè)序結(jié)果。熒光標(biāo)記測(cè)序循環(huán)測(cè)序反應(yīng)原理示意圖測(cè)序峰圖的簡(jiǎn)單分析我們所用的峰圖分析軟件為：SequenceScannerV1.0，Bioedit等DNA測(cè)序儀的發(fā)展平板凝膠電泳毛細(xì)管電泳SimpleGelLoadingLongReadIRDNASequencerGeneReadIRDNAAnalysisSystemBIOTECHNOLOGYDIVISIONAB公司DNA分析儀大家族平板凝膠電泳式：377-36,377-96

毛細(xì)管電泳式：310,3100和

3700，3730XLABIPRISM377DNASequencerABIPRISM377測(cè)序儀ABIPRISM310遺傳分析儀ABIPRISM3100遺傳分析儀ABIPRISM3700遺傳分析儀ABIPRISM3730遺傳分析儀二、第二代高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介四大高通量測(cè)序平臺(tái)

Solexa，454(GS-FLX)，

SOLiD和Polonator測(cè)序原理合成法測(cè)序(SequencingbySynthesis)

連接法測(cè)序(SequencingbyLigation)

(一)454(GS-FLX)Roche：（2005，2007，2008）原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。

RocheGSFLXSystem是一種基于焦磷酸測(cè)序原理而建立起來(lái)的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)。在測(cè)序時(shí)，使用了一種叫做“PicoTiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬(wàn)個(gè)由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物。測(cè)序開(kāi)始時(shí)，放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在各種酶的作用下，經(jīng)過(guò)一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。454測(cè)序流程454測(cè)序流程與BaseCalling每次加入一種堿基，再對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行讀取，如果不能和加入堿基配對(duì)則沒(méi)有信號(hào)，如果有單個(gè)堿基配對(duì)則可檢測(cè)到一倍的信號(hào)，如果有連續(xù)多個(gè)可配對(duì)堿基則可檢測(cè)到多倍強(qiáng)度的熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度和堿基個(gè)數(shù)成正比。454(GS-FLX)流程1、文庫(kù)制備：基因組DNA/cDNA片段化處理至300-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA。454(GS-FLX)流程2、EmulsionPCR：?jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被固定在DNA捕獲磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，回收純化；

454(GS-FLX)流程3、測(cè)序反應(yīng)：攜帶DNA片段的磁珠被放入PTP板中供測(cè)序反應(yīng)使用。454(GS-FLX)流程4、數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100余萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)4-6億個(gè)堿基信息454的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，400－600bp通量較低，1Run1M序列，400－600Mb相對(duì)成本較高主要應(yīng)用：denovo測(cè)序（二）Solexa-IlluminaGenomeAnalyzer核心技術(shù)：“DNA簇”和“可逆性末端終止”。原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億計(jì)Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。

IlluminaSolexa簡(jiǎn)介橋式PCR邊合成邊測(cè)序可逆終止物HiSeq2000IlluminaSolexa測(cè)序流程IlluminaSolexa橋式PCRdioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionIlluminaSolexaBaseCalling123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Solexa的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究（三）SOLiD

ABI(AppliedBiosystems)：SOLiD(SequencingbyOligonucleotideLigationandDetection)原理：用連接法測(cè)序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點(diǎn)。SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測(cè)序：通過(guò)連接酶連接，再對(duì)oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)SOLiD5500xlABISOLiD測(cè)序原理單向SOLiD測(cè)序包括五輪測(cè)序反應(yīng)，每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。第一輪測(cè)序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測(cè)序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理斷裂探針3’端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去6~8位堿基及5’末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5’磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)榈谝淮芜B接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息……SOLiD流程1、SOLiD基因組文庫(kù)的構(gòu)建

SOLiD流程2、油包水PCR

SOLiD流程3、含DNA模板P1磁珠的固定

SOLiD流程4、SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程

SOLiD流程4、SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程

Solexa的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究SOLiD的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，50-75bp精度高，可達(dá)Q40通量高，20-30G每天，1Run可達(dá)120G主要應(yīng)用：基因組重測(cè)序、SNP檢測(cè)等（四）Polonator

測(cè)序原理：

Polonator系統(tǒng)高質(zhì)量測(cè)序是一種以連接反應(yīng)進(jìn)行DNA序列分析的技術(shù)，該系統(tǒng)采用結(jié)合在磁珠上單分子DNA片段簇為測(cè)序模板，以CY5、TexasRed、CY3、6-FAM四色熒光標(biāo)記的9堿基單鏈熒光探針混合物進(jìn)行連續(xù)的連接反應(yīng)為基礎(chǔ)，對(duì)擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行大規(guī)模高通量測(cè)序。

Polonator流程三、高通量測(cè)序應(yīng)用DNA測(cè)序

全基因組denovo測(cè)序

基因組重測(cè)序

宏基因組測(cè)序

人類外顯子組捕獲測(cè)序RNA測(cè)序

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

小RNA測(cè)序

電子表達(dá)譜測(cè)序表觀基因組研究

ChIP-Seq

DNA甲基化測(cè)序基因組測(cè)序基因組測(cè)序是對(duì)物種的基因組DNA打斷后進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)是否有已知基因組數(shù)據(jù)主要分為denovo全基因組測(cè)序和基因組重測(cè)序。Denovo基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行基因組從頭測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)序列進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析?；蚪M測(cè)序策略Paired-EndMate-End基因組測(cè)序流程－兩種測(cè)序策略Paired-end原理50100bps100bps3000bpsPaired-end基因組重排分析

Paired-end和測(cè)序深度對(duì)測(cè)序效果的影響JunWang,etal.Nature456,60-65(6November2008)基因組測(cè)序的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)產(chǎn)出處理：圖像識(shí)別與BaseCalling\去除接頭序列、檢測(cè)與去除污染序列等；基因組組裝：原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、測(cè)序深度分析、組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)等；基因組注釋：CodingGene注釋、RNA分類注釋、重復(fù)序列注釋等；基因功能注釋：GO功能分類、Interpro功能分類等；比較基因組及分子進(jìn)化分析：SNP/InDel/CNV檢測(cè)等。References1、ErinD.Pleasance,PhilipJ.Stephens,SarahO’Meara,etal..Asmall-celllungcancergenomewithcomplexsignaturesoftobaccoexposure.Nature,2010,463:184-190.2、MichaelJamesClark,NilsHomer,BrainD.O’Connor,etal..U87MGDecoded:TheGenomicSequenceofaCytogeneticallyAberrantHumanCancerCellLine.PloSGenetics,2010,6(1):e1000832.3、WeiChen,ReinhardUllmann,ClaudiaLangnick,etal..Breakpointanalysisofbalancedchromosomerearrangementsbynext-generationpaired-endsequencing.EuropeanJournalofHumanGenetics,2010,18:539-543.4、VanTassellCP,SmithTP,MatukumalliLK,TaylorJF,SchnabelRd,etal.Whole-genomesequencingandvariantdiscoveryinC.elegans.NatMethods,2008,5(2):183-188.5、JunWang,WeiWang,RuiqiangLi,etal..ThediploidgenomesequenceofanAsianindividual.Nature456,60-65(6November2008)6、HuangSW,LiRQ,WangJ,etal.TheGenomeoftheCucumber(CucumissativusLinnaeus).

NatureGenetics2009;doi:10.1038/ng.4757、DavidHernandez,etal.Denovobacterialgenomesequencing:Millionsofveryshortreadsassembledonadesktopcomputer.GenomeRes.

2008.18:

802-80954基因組重測(cè)序案例分析ErinD.Pleasance,etal.Thecompendiumofsomaticmutationsinasmall-celllungcancergenome.Nature,2010,463:184-190.此研究用高通量測(cè)序?qū)σ粋€(gè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI－H209基因組進(jìn)行重測(cè)序，以探討吸煙引發(fā)該細(xì)胞系基因組中特定堿基及其周圍序列的突變及細(xì)胞損傷修復(fù)原理。肺癌基因組變異情況統(tǒng)計(jì)圖基因組重排和CNV分析從頭基因組測(cè)序案例DavidHernandez,etal.Denovobacterialgenomesequencing:Millionsofveryshortreadsassembledonadesktopcomputer.GenomeRes.

2008.18:

802-809此研究對(duì)Staphylococcusaureus

strainMW2和Helicobacteracinonychis

strainSheeba兩種細(xì)菌基因組進(jìn)行從頭測(cè)序，并比較了幾種拼接方法的效果。多種拼接軟件拼接結(jié)果比較多種拼接軟件拼接結(jié)果比較五種拼接方法的拼接結(jié)果比對(duì)宏基因組測(cè)序宏基因組測(cè)序是對(duì)某一特定環(huán)境，如腸道、土壤、海水等中的所有微生物進(jìn)行基因組測(cè)序。通過(guò)此方法可對(duì)該環(huán)境中的微生物種類和優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行檢測(cè)，揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系。自然環(huán)境中很多微生物無(wú)法分離培養(yǎng)，而此方法無(wú)需對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)。宏基因組測(cè)序方法現(xiàn)在有全基因組的宏基因組測(cè)序和16S/18SrRNA宏基因組測(cè)序。全基因組的宏基因組測(cè)序通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)環(huán)境樣品的總DNA直接進(jìn)行全基因組的宏基因組測(cè)序，能夠?qū)崿F(xiàn)微生物群落的物種分類研究、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、功能注釋以及物種間的代謝網(wǎng)絡(luò)研究，挖掘具有應(yīng)用價(jià)值的基因資源，開(kāi)發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。與傳統(tǒng)的Sanger法相比，速度快，性價(jià)比高，周期短，單個(gè)樣品的測(cè)序量可以接近飽和。宏基因組測(cè)序信息分析主要內(nèi)容拼接組裝物種分類組成分析基因預(yù)測(cè)和功能注釋生成Profilingtable主成分分析（PCA）篩選與樣品分組顯著相關(guān)的因子多樣品間比較分析16S/18SrRNA宏基因組測(cè)序16S/18S

rRNA是微生物群落分析和細(xì)菌進(jìn)化研究以及分類研究最常用的靶分子，采用新一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)16S/18SrDNA的可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，不需進(jìn)行克隆篩選，能全面的反映微生物群體的物種組成，真實(shí)的物種分布及豐度信息。16S/18SrRNA測(cè)序信息分析內(nèi)容物種分類、物種豐度分析OTU（Operational

TaxonomicUnits）分析多樣性分析系統(tǒng)進(jìn)化分析多樣品間的比較分析ReferencesMeyer,F;PaarmannD,D'SouzaM,OlsonR,GlassEM,KubalM,(2008)."ThemetagenomicsRASTserver-apublicresourcefortheautomaticphylogeneticandfunctionalanalysisofmetagenomes".

BMCBioinformatics

9:0.

doi:10.1186/1471-2105-9-386.

GeorgeIetal.(2010)."ApplicationofMetagenomicstoBioremediation".Metagenomics:Theory,MethodsandApplications.CaisterAcademicPress.

WongD(2010)."ApplicationsofMetagenomicsforIndustrialBioproducts".Metagenomics:Theory,MethodsandApplications.CaisterAcademicPress.

NelsonKEandWhiteBA(2010)."MetagenomicsandItsApplicationstotheStudyoftheHumanMicrobiome".

Metagenomics:Theory,MethodsandApplications.CaisterAcademicPress.

CharlesT(2010)."ThePotentialforInvestigationofPlant-microbeInteractionsUsingMetagenomicsMethods".

Metagenomics:Theory,MethodsandApplications.CaisterAcademicPress.

Allen,EE;Banfield,JF(2005)."Communitygenomicsinmicrobialecologyandevolution".

NatureReviewsMicrobiology

3

(6):489–498.Zheng,Hao;Wu,Hongwei(2010)."ShortprokaryoticDNAfragmentbinningusingahierarchicalclassifierbasedonlineardiscriminantanalysisandprincipalcomponentanalysis.".

JBioinformComputBiol.

8

(6):995–1011.人類外顯子組捕獲測(cè)序外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的大部分功能性變異。

與全基因組重測(cè)序相比，外顯子組測(cè)序只需針對(duì)外顯子區(qū)域的DNA，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效。67人類外顯子組捕獲測(cè)序原理人類外顯子組捕獲測(cè)序分析流程檢測(cè)序列變異分析示例檢測(cè)到SNP數(shù)統(tǒng)計(jì)序列InDel檢測(cè)References1、WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet.

2011Apr15.[Epubaheadofprint]2、JanelO.Johnson,J.RaphaelGibbs,etal.ExomeSequencinginBrown-Vialetto-VanLaereSyndrome.AmJHumGenet.

2010October8;

87(4):567–569.3、TeerJK,

MullikinJC.Exomesequencing:thesweetspotbeforewholegenomes.HumMolGenet.

2010Oct15;19(R2):R145-51.Epub2010Aug12.4、LeyTJ,MardisER,DingL,etal.DNAsequencingofacytogeneticallynormalacutemyeloidleukaemiagenome.Nature2008;456(7218):66-725、GnirkeA,MelnikovA,MaguireJ,etal.Solutionhybridselectionwithultra-longoligonucleotidesformassivelyparalleltargetedsequencing.NatBiotechnology2009;27(2):182-9.6、MurimChoia,UteI.Scholla,WeizhenJia,etal.(2010)GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing.

PNAS.106:19096-19101.7、SarahBNg,KatiJBuckingham,CholiLee,etal.(2010)Exomesequencingidentifiesthecauseofamendeliandisorder.

NatureGenetics

42,30-35.71人類外顯子組捕獲測(cè)序案例WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet.

2011Apr15.[Epubaheadofprint]

黑色素瘤發(fā)生率一直在上升，此研究對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行外顯子組捕獲測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了和其相關(guān)的高頻突變基因。七個(gè)新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點(diǎn)單個(gè)基因中突變位點(diǎn)分析基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding

RNA)。

第二代測(cè)序系統(tǒng)可精確檢測(cè)單個(gè)堿基，并且不受到研究中先驗(yàn)信息的干擾，科研人員能夠快速地獲得某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA轉(zhuǎn)錄本序列，從而能夠開(kāi)展：UTRs區(qū)域界定、可變剪切研究、低豐度新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)、融合基因鑒定、cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）研究等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序測(cè)序流程全轉(zhuǎn)錄組總RNApolyT富集mRNA去除rRNANon-codingRNA轉(zhuǎn)錄組mRNARNA片段化、純化、檢測(cè)產(chǎn)量連接兩端接頭序列逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA選擇適當(dāng)長(zhǎng)度cDNA進(jìn)行擴(kuò)增純化擴(kuò)增產(chǎn)物，評(píng)估產(chǎn)量上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序測(cè)序流程無(wú)參考序列測(cè)序流程有參考序列測(cè)序流程轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容無(wú)參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容有參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容1測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)成分和質(zhì)量評(píng)估；2Contig及Scaffold長(zhǎng)度分布3Unigene的長(zhǎng)度分布和功能注釋，GO分類，Pathway分析，差異表達(dá)分析4蛋白功能預(yù)測(cè)與分類，差異表達(dá)基因GO富集和Pathway富集分析。1基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，比對(duì)參考序列2序列在基因組上在分布3測(cè)序深度分析、隨機(jī)性評(píng)估和基因差異表達(dá)分析4新基因預(yù)測(cè)，基因可變剪接鑒定和基因融合鑒定等。ReferencesMaherCA,Kumar-SinhaC,

CaoX,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009Mar5;458(7234):97-101.GuojieZhang,GuangwuGuo,XuedaHu,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.GenomeRes.

2010May;20(5):646-54.MurchisonEP,

TovarC,

HsuA,etal.TheTasmaniandeviltranscriptomerevealsSchwanncelloriginsofaclonallytransmissiblecancer.Science.

2010Jan1;327(5961):84-7.BrainB.Tuch,RebeccaR.Laborde,XingXuetal.TumorTranscriptomeSequencingRevealsAllelicExpressionImbalancesAssociatedwithCopyNumberAlterations.PloSONE,2010,5(2):e9317FuchouTang,CatalinBarbacioru,EllenNordmanetal.RNA-Seqanalysistocapturethetranscriptomelandscapeofasinglecell.NatureProtocols,2010,ePubFebrary25.SohrabP.Shah,RyanD.Morin,JaswinderKhattraetal.Mutationalevolutioninalobularbreasttumorprofiledatsinglenucleotideresolution.Nature,2009,461:809-813Zhaoetal.

Transcriptome-guidedcharacterizationofgenomicrearrangementsinabreastcancercellline.

PNAS106(6):1886-91.(2009)GregoryR,

DarbyAC,

IrvingH,etal.AdenovoexpressionprofilingofAnophelesfunestus,malariavectorinAfrica,using454pyrosequencing.PLoSOne.

2011Feb25;6(2):e17418.

CrawfordJE,GuelbeogoWM,SanouA,TraoréA,VernickKD,etal.(2010)

DeNovoTranscriptomeSequencingin

Anophelesfunestus

UsingIlluminaRNA-SeqTechnology.PLoSONE5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202有參考序列轉(zhuǎn)錄組測(cè)序案例MaherCA,Kumar-SinhaC,

CaoX,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009Mar5;458(7234):97-101.此研究使用454和Solexa兩種高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)前列腺癌細(xì)胞系VcaP和LNCaP轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)和研究前列腺癌細(xì)胞系中基因融合表達(dá)情況?；蛉诤戏治龌蚯逗戏治隽鞒蘉IPOL1-DGKB

基因融合模式無(wú)參考序列轉(zhuǎn)錄組測(cè)序案例CrawfordJE,GuelbeogoWM,SanouA,TraoréA,VernickKD,etal.(2010)

DeNovoTranscriptomeSequencingin

Anophelesfunestus

UsingIlluminaRNA-SeqTechnology.PLoSONE5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202此研究通過(guò)對(duì)3個(gè)按蚊樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)拼接組裝后，和相近物種進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。Denovo序列拼接、組裝和比對(duì)流程拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)拼接和變異檢測(cè)分析流程圖比較基因組分析各類功能基因中氨基酸在物種間差異比例差異同源蛋白GO分類進(jìn)化關(guān)系分析電子表達(dá)譜測(cè)序?qū)μ囟ㄌ幚項(xiàng)l件下的全基因組基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，已被廣泛用于功能基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。電子表達(dá)譜測(cè)序（DigitalGeneExpression,DGE）又稱為基因表達(dá)標(biāo)簽測(cè)序（mRNAtagprofiling），其原理是通過(guò)兩種酶切作用對(duì)基因中一段長(zhǎng)度為21nt的序列標(biāo)簽進(jìn)行測(cè)序。由于其測(cè)序只針對(duì)表達(dá)的基因進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量相對(duì)較小，是研究基因表達(dá)譜的經(jīng)濟(jì)而快速的研究手段。又稱Tag-SAGE電子表達(dá)譜測(cè)序流程圖NlaIII限制性酶切電子表達(dá)譜分析內(nèi)容圖像識(shí)別與原始?jí)A基數(shù)據(jù)讀取。去污染、去接頭，標(biāo)簽序列計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)?；蚪M比對(duì)與統(tǒng)計(jì)，基因序列比對(duì)獲得所表達(dá)的基因列表基因差異表達(dá)分析。聚類與表達(dá)類型分析。GO基因富集與分類分析。Pathway富集與分類分析。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。反義鏈轉(zhuǎn)錄本與新轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)。ReferencesMorrissyAS,etal.Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling.GenomeRes.2009.19(10):1825-1835.'tHoenPA,etal.Deepsequencing-basedexpressionanalysisshowsmajoradvancesinrobustness,resolutionandinter-labportabilityoverfivemicroarrayplatforms.NucleicAcidsRes,2008.36(21):e141(1-11).style7">3.HegedusZ,etal.Deepsequencingofthezebrafishtranscriptomeresponsetomycobacteriuminfection.MolImmunol,2009.46(15):2918-2930.AudicSandClaverieJM.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles.GenomeRes.1997.7(10):986-995.ZhenhuaJeremyWu,

CliffordA.Meyer,SibgatChoudhury,etal.GeneexpressionprofilingofhumanbreasttissuesamplesusingSAGE-Seq.

GenomeRes.

2010.20:

1730-1739AndreaL.Eveland,NamikoSatoh-Nagasawa,AlexanderGoldshmidt,etal.DigitalGeneExpressionSignaturesforMaizeDevelopment.PlantPhysiol.,2010

154:

1024-1039PeterRuzanovandDonaldL.Riddle.DeepSAGEanalysisoftheCaenorhabditiseleganstranscriptome.NucleicAcidsResearch,2010,Vol.38,No.10SaurabhSaha,AndrewB.Sparks,CarloRago,etal.Usingthetranscriptometoannotatethegenome.NatureBiotechnology

(2002)20,508-512電子表達(dá)譜測(cè)序案例分析MorrissyAS,etal.Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling.GenomeRes.2009.19(10):1825-1835.此研究用高通量電子表達(dá)譜測(cè)序（Tag-SAGE）和傳統(tǒng)LongSAGE測(cè)序方法對(duì)癌癥細(xì)胞進(jìn)行研究，比較兩種方法效果，揭示了電子表達(dá)譜在基因發(fā)現(xiàn)中的諸多優(yōu)勢(shì)，可發(fā)現(xiàn)更多的基因，減少GC偏好。兩種方法所檢測(cè)到的基因數(shù)比較GC偏好性和低豐度轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)效果小RNA測(cè)序小RNA是指長(zhǎng)度在21-31nt的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼RNA，廣泛存在于高等和低等生物體內(nèi)，其對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等生命過(guò)程起到調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)已知小RNA可