丹參紅花水溶性有效組分對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

丹參紅花水溶性有效組分對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

中藥藥物的配藥是中醫(yī)學(xué)組合的核心，也是中醫(yī)學(xué)研究的最簡單形式。丹參和紅花是傳統(tǒng)活血化瘀藥中應(yīng)用最早且藥理作用最為廣泛的藥對之一,丹參和紅花提取物配伍在臨床上得到廣泛應(yīng)用并取得了較好的療效,尤其在治療心肌缺血疾病方面有顯著治療作用。丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根及根莖,其主要水溶性有效成分包括丹參素、原兒茶醛和丹酚酸類成分,其中含量最高的2個成分丹酚酸A(SalA)和丹酚酸B(SalB)活性最強,近年的藥理研究表明,丹酚酸在抗氧化應(yīng)激損傷、抗動脈粥樣硬化及心肌缺血等方面具有顯著活性。紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的筒管狀花冠,紅花的化學(xué)成分主要為黃酮和脂肪油兩大類,其中查耳酮類化合物紅花黃色素(saffloryellow,SY)為紅花的主要有效成分,是含有多種成分的水溶性混合物,其中羥基紅花黃色素A(hydroxysaffloryellowA,HSYA)為紅花黃色素中含量較高的成分,具有擴張冠狀動脈、改善心肌缺血、減少AMI范圍的作用。丹參和紅花2味藥物水溶性組分是復(fù)雜的水溶性混合物,其水溶性部位化學(xué)成分的研究有一定難度且化學(xué)成分不穩(wěn)定。因此基于定量指紋圖譜技術(shù)對丹參、紅花進行定性、定量化學(xué)質(zhì)量控制,對其水溶性的多個目標(biāo)成分尤其是有效成分進行準(zhǔn)確定量,提高其生藥含量,并使得2味中藥所對應(yīng)的化學(xué)組成更加清晰和穩(wěn)定性可靠。本實驗研究將丹參、紅花水溶性有效組分(丹酚酸B和羥基紅花黃色素A)含量提高后進行配伍,觀察其對大鼠實驗性心肌缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury,IRI)的作用。1材料表面1.1動物許可證SD大鼠70只,體重180~200g,雌雄各半,清潔級,動物許可證號SCXK(京)2007-0001,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。清潔級動物房飼養(yǎng),定時給予全價營養(yǎng)飼料喂食,室溫22~25℃,濕度50%~70%。1.2丹紅注射液組5.0.0%丹參水溶性組分注射液(丹酚酸B49g·L-1,約相當(dāng)于生藥104g·mL-1),紅花水溶性組分注射液(羥基紅花黃色素A31.76g·L-1,約相當(dāng)于生藥80.87g·mL-1),丹參紅花水溶性組分配伍注射液(丹酚酸B34.3g·L-1,羥基紅花黃色素A22.21g·L-1)由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供;丹紅注射液(原兒茶醛0.05g·L-1,約相當(dāng)于生藥1g·mL-1),由山東濟南步長制藥有限公司生產(chǎn),批號060904。肌鈣蛋白T(CardiactroponinT,cTnT)試劑盒由美國RapidBioLab公司生產(chǎn),北京萊博特利生物醫(yī)學(xué)科技公司提供,批號08060502;肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供,批號070181;硝基四氮唑藍(lán)(NBT),上海前進試劑廠生產(chǎn),批號060509。血栓素(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)放射免疫試劑盒,由北京普爾偉業(yè)生物技術(shù)有限公司提供,批號20070607;二磷酸腺苷(adenosinediphosphate,ADP),由美國CHRONO-LOG公司生產(chǎn),北京現(xiàn)代威士達(dá)醫(yī)療器械有限公司提供,批號3368,濃度0.2mmol·L-1。1.3儀器、試劑與儀器SC-3人工呼吸機(上海醫(yī)療設(shè)備廠);ECG-6511心電圖機(上海光電儀器有限公司);RX-2000全自動生化儀(美國Technicon公司);LBY-NJ2血小板聚集儀(北京普利生公司);SN-682放射免疫γ計數(shù)儀(上海核輻射儀器有限公司)。2動物分組、藥物成分檢測2.1動物模型制作20%氨基甲基乙酯(烏拉坦)腹腔注射麻醉(0.7mL·kg-1),大鼠固定在專用木板上,氣管插管,人工呼吸(潮氣量為20mL·kg-1,呼吸頻率為50次/min)吸入室內(nèi)空氣,開胸,剪開心包膜,輕輕擠壓大鼠胸腔右側(cè)壁,將心臟擠出。在左心耳下緣,肺動脈圓錐左緣與左心耳之間進針,以冠狀靜脈主干為標(biāo)志,左心耳下方2~3mm處用絲線結(jié)扎(墊1個半圓形硅膠管)冠狀動脈前降支造成大鼠心肌缺血,心電監(jiān)護顯示結(jié)扎冠狀動脈成功(持續(xù)2min)后10min經(jīng)股靜脈iv給藥。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎,注射等劑量生理鹽水;模型組結(jié)扎后,給予等劑量生理鹽水。實驗過程中動物處置方法符合動物倫理學(xué)要求標(biāo)準(zhǔn)。2.2動物分組實驗分為假手術(shù)(空白對照)組:只穿刺不結(jié)扎,注射等量生理鹽水;模型組:注射等劑量生理鹽水;陽性藥物對照組:丹紅注射液,給藥劑量為0.36mL·kg-1,約合生藥1.8g·kg-1;丹參水溶性有效組分組:給藥量為0.30mL·kg-1,約合生藥30.68g·kg-1;紅花水溶性有效組分組:給藥量為0.22mL·kg-1,約合生藥17.87g·kg-1;丹參紅花水溶性有效組分配伍(按生藥量3∶1配制)低劑量組:給藥量0.42mL·kg-1,約合生藥24.28g·kg-1;丹參紅花水溶性有效組分配伍高劑量組:給藥量0.82mL·kg-1,約合生藥48.56g·kg-1。所有注射藥液均用生理鹽水稀釋,按10mL·kg-1給予動物注射。2.3標(biāo)本采集大鼠造模缺血后40min,剪斷絲線再灌注120min。記錄結(jié)扎前、結(jié)扎后10,40min及剪開絲線后(再灌注)30,60,120minⅡ?qū)碾妶D。觀察120min后,腹主動脈取血,一部分放入3.8%枸櫞酸鈉溶液1∶9抗凝真空管和消心痛+2%EDTANa2溶液抗凝管后離心,測定血小板聚集性和TXB2,6-keto-PGFα1含量。另一部分不抗凝放入真空管后離心測定血清cTnT,CK-MB含量。然后,取出心臟,生理鹽水沖洗,稱量全心重,在心臟結(jié)扎線以下,平行于冠狀溝均勻地將左心室部分橫斷切成5片,置于NBT溶液37℃染色15min。用DeltaPix(丹麥)圖像分析系統(tǒng)測量每片心肌面積、心室面積和梗死區(qū)面積,然后求出梗死區(qū)占心室和全心區(qū)面積的百分比。2.4指標(biāo)檢測方法放射免疫法測定TXB2,6-keto-PGFα1;全自動生化儀電化學(xué)發(fā)光法和速率法測定測定cTnT,CK-MB;比濁法測定血小板聚集率,誘導(dǎo)劑為ADP,濃度為0.2mmol·L-1,取其1,3,5min及最大聚集率。2.5統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示,組間比較為單因素方差分析,組間比較采用LSD方法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,采用SPSS12.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。3結(jié)果3.1對小鼠血清分析方法的影響大鼠心肌I/R損傷后,血清CK-MB活性明顯升高,和假手術(shù)組比較有顯著差異(P<0.01)。模型組cTnT水平亦有一定升高,但與假手術(shù)組比較無顯著差異,穿刺對心肌組織也是一種損傷。與模型組比較,丹參組分、紅花組分、丹參紅花組分低、高劑量組均能顯著降低動物血清CK-MB水平和cTnT含量(P<0.01)。與模型組比較,丹紅注射液、丹參組分、紅花組分、丹參紅花組分低、高劑量組的心肌梗死面積分別下降了14.28%,31.96%,21.45%,25.98%,39.82%,梗死面積下降百分比=模型組心肌梗死面積-藥物組心肌梗死面積)/模型組心肌梗死面積×100%,見表1。3.2丹紅注射液和模型組st-t的比較結(jié)扎動物冠狀A(yù)后,各組大鼠Ⅱ?qū)碾妶DST-T皆有一定的升高。剪開絲線后30min時,丹紅注射液組、丹參組分、丹參紅花組分配伍低、高劑量組ST-T升高幅度有一定的降低,和模型組比較有顯著差異(P<0.05),120min時,還有同樣的效果,見表2。3.3各組大鼠心肌缺血再灌注損傷后血清5-keto-pgf1的含量血小板聚集性、6-keto-PGF1α和TXB2的影響大鼠再灌流120min后取血測定血小板聚集性,與模型組比較,丹參組分及其配伍高、低劑量均能顯著降低血小板最大聚集率(P<0.01,P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷后模型組大鼠血漿6-keto-PGF1α含量下降,但和假手術(shù)組比較無顯著差異。丹參紅花組分配伍高、低劑量能明顯升高6-keto-PGF1α含量,和模型組比較有顯著差異(P<0.05),升高幅度和丹紅注射液比較有顯著差異(P<0.01)。丹紅注射液、丹參組分和丹參紅花組分配伍大劑量組能降低TXB2含量,和模型組比較有顯著差異(P<0.01),見表3。4對大鼠心肌再灌注損傷的影響雖然早期、及時再灌注心臟是防止心肌組織缺血造成進一步損害的有效方法,但缺血組織恢復(fù)血流灌注時,往往導(dǎo)致再灌注區(qū)域心肌細(xì)胞及局部血管網(wǎng)顯著的病理變化,而這些改變的共同作用可導(dǎo)致進一步的組織損傷即IRI。臨床上所見的心肌無復(fù)流、心肌鈍抑、再灌注心律失常、心肌組織壞死和微血管功能障礙相關(guān)現(xiàn)象均證實了血管開通后I/R損傷的存在。再灌注損傷導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的組織損傷和細(xì)胞壞死是心肌缺血引發(fā)直接結(jié)果。再灌注損傷的基本病理生理學(xué)機制尚未完全闡明,影響其發(fā)病機制涉及自由基損傷、鈣超載、細(xì)胞損傷、血小板等方面,應(yīng)用氧自由基清除劑、抗血小板聚集劑、抑制炎癥反應(yīng)等是潛在的藥理學(xué)治療靶標(biāo),同時補充能量腺苷等藥物能明顯減輕組織的再灌注損傷。臨床研究表明中藥可通過多層次、多靶點抑制組織氧化反應(yīng)、炎癥細(xì)胞浸潤、抗血小板聚集等多種途徑干預(yù)心肌I/R,以保護再灌注損傷的心臟,而發(fā)揮獨特作用的優(yōu)勢。缺血損傷心肌導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜通透性改變,細(xì)胞內(nèi)CK-MD漏出增加,檢測血清CK-MD活性是臨床常用的生化指標(biāo)之一。心肌酶譜診斷急性心肌梗死(AMI)的敏感性與發(fā)病時間長短有關(guān),臨床研究表明AMI患者的CK-MB的在2~4h內(nèi)升高,24h達(dá)到峰值,實驗造成大鼠急性再灌注損傷后,其血清CK-MB活性明顯升高,2h后取血測定,雖然沒有達(dá)到峰值,但較假手術(shù)組上升了65.52%,而心肌特異性的cTnT是心肌損傷的敏感生化指標(biāo)。假手術(shù)組大鼠cTnT因穿刺心肌組織造成損傷而升高,并早于CK-MB(假手術(shù)組大鼠CK-MB略高于正常值),cTnT陰性基本可以排出AMI,其特異性和時間窗優(yōu)于CK-MB。PGI2/TXA2失衡是加劇缺血心肌損傷的重要原因,PGI2能抑制血小板聚集,增強一氧化氮的釋放而舒張血管,保護心肌組織。而TXA2則促進血小板聚集,收縮血管,加重缺血組織損傷。心肌再灌注損傷后導(dǎo)致PGI2/TXA2平衡失調(diào),激活中性粒細(xì)胞釋放炎癥因子,導(dǎo)致再灌注損傷發(fā)生。IRI是缺血損傷的延續(xù),在缺血期及早使用藥物干預(yù),可以減輕心肌細(xì)胞的缺血性損傷,增強心肌細(xì)胞對IRI的抵抗能力。結(jié)扎冠狀A(yù)造成大鼠心肌再灌注損傷,120min時假手術(shù)組和模型組大鼠的cTnT含量增高明顯,模型組CK-MB活性比假手術(shù)組升高顯著(P<0.01)。各給藥組均能顯著降低大鼠cTnT水平(P<0.01),對CK-MB活性,各給藥組亦有不同程度降低作用(P<0.05,P<0.01)。而丹參紅花組分配伍在減少大鼠心肌梗死面積較丹紅注射液提高了45.03%,顯示了丹參、紅花其有效組分含量提高后的配伍優(yōu)勢。實驗首先從模型組開始,因手法原因?qū)е履Ｐ徒M結(jié)扎前的ST幅度增高,和其他組比較尚無統(tǒng)計學(xué)差異。丹參紅花組分配伍高、低劑量組可明顯降低大鼠心電圖ST-T升高的幅度,改善心肌缺血程度,一直持續(xù)到120min,和模型組比較差異顯著。實驗研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)穿刺對大鼠心肌也造成一定的應(yīng)激和損傷,模型組的血小板聚集和TXB2指標(biāo)明顯升高,但和假手術(shù)組比較無顯著差異。丹參紅花組分能降低TXB2含量,升高6-keto-PGF1α含量,同時糾正PGI2/TXA2平衡失調(diào)。丹參紅花組分對機體的血小板聚集性作用最為顯著,丹參組分亦有明顯降低血小板聚集性的作用。實驗結(jié)果表明,丹參、紅花側(cè)重面亦有所不同,其配伍顯示了療效的優(yōu)勢,顯著抑制血栓烷的生成,防治血栓的形成和改善心肌微循環(huán)及心肌缺血狀態(tài)。人們對丹參和紅花的水溶性成分研究較晚但發(fā)展迅速,先后分離得到了一系列水溶性化合物,并得到廣泛的應(yīng)用。丹酚酸是從丹參中提取的一類既有咖啡?？s酚酸結(jié)構(gòu)又有新木脂素骨架的水溶性成分。現(xiàn)代藥理研究表明,丹參水溶性提取物具有增強冠狀動脈血流量、抗脂質(zhì)過氧化、抑制血栓形成及抗血栓、改善微循環(huán)等作用。紅花在我國僅有一種,紅花有效部位的藥理研究主要集中在查爾酮類化合物SY,SY是一種復(fù)雜的水溶性混合物,而HYSA是SY中的主要成分?，F(xiàn)代研究表明,紅花水溶性提取物具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化、改善神經(jīng)系統(tǒng)障礙等作用。傳統(tǒng)中藥多采用水煎劑型,其化學(xué)成分含有大量的強極性組分,這些強極性組分的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理藥效的研究是新的中藥研究領(lǐng)域。采用中藥指紋圖譜技術(shù)與多指標(biāo)成分定量分析相結(jié)合的中藥質(zhì)量控制模式,將丹參定量組分中的水溶性有效組分