化學(xué)半合成法分離純化長春瑞濱粗產(chǎn)物

化學(xué)半合成法分離純化長春瑞濱粗產(chǎn)物

長春瑞林堿（ivl）也被稱為去甲基長春堿、異長春堿、失碳長春堿或脫甲基長春堿。1989年，法國皮爾法比首次生產(chǎn)并上市。長春瑞濱作為一種化學(xué)半合成的長春花類生物堿抗腫瘤藥物,具有抗癌活性高、抗瘤譜廣、毒副作用小等特點,目前臨床上已用單藥或聯(lián)合用藥治療非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤等。合成長春瑞濱所用的原料主要是天然提取的長春堿,由于其中含有很多結(jié)構(gòu)類似的生物堿,加之從長春堿到長春瑞濱至少需要經(jīng)過3步復(fù)雜的有機反應(yīng),過程中往往伴生出許多新的雜質(zhì),因此分離純化工作一直是規(guī)?；a(chǎn)長春瑞濱原料藥的難點之一。目前國內(nèi)外報道的純化制備長春瑞濱的方法主要是通過反復(fù)多次過硅膠柱或氧化鋁柱,再結(jié)合重結(jié)晶技術(shù)獲得原料藥,但是這些方法在實踐中也存在一些問題。一是需要多次過柱才能達到較好的純化目的;二是硅膠或氧化鋁的吸附能力較強,目標(biāo)產(chǎn)物易發(fā)生不可逆吸附,因而收率較低;三是反復(fù)多次過柱耗時、耗費大量有機溶劑,引起環(huán)境污染。另外填裝好的硅膠柱一般很難重復(fù)使用,反復(fù)填柱不僅增加了工人的勞動強度,原材料成本也相應(yīng)提高。利用反相聚苯乙烯填料MCI-GELCHP-20對中草藥有效成分進行分離純化顯示了良好的應(yīng)用潛力。在前期實驗中筆者發(fā)現(xiàn)該類填料能將多個結(jié)構(gòu)相似的長春花類生物堿很好的分離,但由于該類高效能的商品化填料目前價格較貴,且需要消耗大量色譜純的有機流動相,運行成本較高。如果直接使用反應(yīng)后的粗提物,易造成填料變性、失效。所以在利用MCI-GELCHP-20填料精制長春瑞濱之前,有必要對合成的長春瑞濱粗品進行初分離。實驗中采用正相快速干柱硅膠與反相聚苯乙烯柱組合,分離純化長春瑞濱,為研究開發(fā)出一種高效、實用的分離純化長春瑞濱新技術(shù)提供依據(jù)。1實驗部分1.1填料及分析純Waters2695高壓液相色譜儀,美國Waters公司;紫外投射反射分析儀,北京新技術(shù)應(yīng)用研究所。薄層色譜硅膠GF254,青島海洋化工有限公司;MCI-GELCHP-20P填料,日本三菱公司。磷酸、正己烷、氯仿、二氯甲烷、無水甲醇、乙酸,分析純,上海振興化工一廠;二乙胺,分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。1.2農(nóng)村地區(qū)農(nóng)村重、堿法分離的產(chǎn)物以硫酸長春堿為原料,在威爾斯邁爾試劑作用下,經(jīng)過脫水反應(yīng)得到脫水長春堿,再將脫水長春堿進行溴代反應(yīng),然后縮環(huán)得到含長春瑞濱的反應(yīng)液,減壓蒸去有機溶劑,得到長春瑞濱粗品。1.3溶劑體系的選擇選擇展開溶劑系統(tǒng):二氯甲烷、甲醇、正己烷、水(少許二乙胺或者乙酸調(diào)節(jié)pH)。調(diào)節(jié)各組分中的濃度,并在薄層色譜硅膠薄板(TLC)上對合成的瑞濱反應(yīng)液進行展開實驗,紫外顯色,選擇出具有最佳展開效果的溶劑體系。正相干柱柱色譜分離:取適量硅膠GF254粉末,活度保持在Ⅱ～Ⅲ級。常壓、干法裝入Φ1.5cm的柱狀PVC塑料膜中,制成1.5cm×15cm的干柱。稱取90mg長春瑞濱粗品,用0.5mL甲醇溶解,加入干柱的頂端,在常壓條件下,采用選擇好的溶劑體系自上而下進行展層,直到溶劑展至柱底,停止展層。將展好的硅膠干柱均分成4段刮出,然后氯仿浸泡振蕩,砂芯漏斗抽濾,減壓濃縮,TLC與高壓液相(HPLC)跟蹤檢測,與標(biāo)樣對照品對比,合并含長春瑞濱的部分,得到中度分離的長春瑞濱。1.4洗脫溶劑和流動相的篩選反相柱色譜是本工藝的關(guān)鍵步驟。采用內(nèi)徑1.0cm的自制層析柱,操作過程如下:MCI-GELCHP-20P用甲醇充分浸泡,脫氣后,用濕法裝柱。每克經(jīng)干柱純化過的瑞濱粗品,用10mL洗脫劑溶解后上柱,再用不同比例的洗脫劑(主要是指甲醇、乙腈、水的組成和成分的比例)進行洗脫,用蠕動泵輸送洗脫劑,流速約為0.2mL/min,分部收集器分段收集流出液,用TLC定性,合并含長春瑞濱的部分,減壓濃縮至干,稱量后用甲醇溶解,經(jīng)HPLC定量分析。流動相的選擇及優(yōu)化:床層高度15cm(床層體積11.8mL),填料負(fù)載量10mg/g,采用不同的洗脫劑(主要是指甲醇、乙腈、水的組成和成分的比例)進行洗脫,得到流動相組成對柱色譜分離過程的影響。負(fù)載量的優(yōu)化:在床層高度15cm(床層體積11.8mL)、不同負(fù)載量情況下,采用V(甲醇)∶V(水)=80∶20洗脫劑進行洗脫,得到負(fù)載量組成對柱色譜分離過程的影響。1.5lc-ms/ms檢測條件采用紅外(IR)、核磁共振(NMR)確認(rèn)樣品的結(jié)構(gòu)。長春瑞濱的含量參照文獻用高效液相色譜測定。HPLC檢測條件:色譜柱為C18柱(Φ4.6mm×250mm,5μm,AmershamBiosciences),柱溫為28℃,流動相V(二乙胺)∶V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=3∶165∶280∶152(磷酸調(diào)pH至6.8),流速1mL/min,檢測波長267nm,進樣量10μL。2結(jié)果與討論2.1分離體系的篩選在硅膠GF254的薄層實驗中,發(fā)現(xiàn)4個溶劑系統(tǒng)能使長春瑞濱的Rf值在0.3～0.8之間,它們分別是:①純甲醇;②V(甲醇)∶V(正己烷)=95∶5;③V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=95∶5;④V(甲醇)∶V(正己烷)∶V(水)=49∶49∶2。長春瑞濱粗品在上述4個展開體系中的TLC結(jié)果如表1所示。綜合比較后選取V(甲醇)∶V(正己烷)=95∶5體系作為干柱色譜的展開劑。以體系②為展開劑,對合成后的粗品進行干柱硅膠分離,將干柱硅膠從上到下均分為4段,用氯仿充分萃取后,用HPLC法定量檢測每段長春瑞濱的含量。結(jié)果顯示,長春瑞濱幾乎全部分布在干柱的第2和第3段硅膠里面,雜質(zhì)主要分布在第1和第4段硅膠里面。第2段和第3段純度大于71.4%和78.3%,與分離前的純度(34.7%)相比,長春瑞濱純度明顯提高。合并第2、第3段蒸干后的殘留物,稱量,計算得干柱色譜回收率為65.9%。2.2抗真浮相mci-gelchp-20柱層析成像2.2.1流動相中甲醇含量對洗脫劑回收率的影響使用MCI-GELCHP-20填料對長春瑞濱粗品進行預(yù)實驗表明,甲醇/水體系可作為良好的洗脫劑體系,進一步對該體系進行優(yōu)化。表2顯示,隨著流動相中甲醇含量的增加,產(chǎn)品純度和洗脫體積顯著下降,產(chǎn)品回收率略有增加。當(dāng)V(甲醇)∶V(水)=80∶20時,既能保證一次性過柱產(chǎn)品純度大于96.0%,又能達到使用較少洗脫液的目的(約為4.2個床層體積)。2.2.2不同率的率差異從表3可見,隨著進料量的增加,產(chǎn)品純度下降,而回收率差異不大,且都很高。如果要求通過一次柱層析達到純度96.0%以上的產(chǎn)品,不能有很高的負(fù)載量(指每克填料負(fù)載的樣品質(zhì)量),合適的負(fù)載量為10mg/g。2.3后農(nóng)村地區(qū)的含量HPLC分析結(jié)果顯示,經(jīng)MCI-GELCHP-20P柱純化后長春瑞濱的含量達到96%。再經(jīng)過V(甲醇)∶V(水)=90∶10溶劑體系緩慢結(jié)晶,晶體過濾、洗滌,HPLC分析結(jié)果表明了純度達98%以上,其IR、NMR、MS譜數(shù)據(jù)與進口標(biāo)準(zhǔn)樣品一致。3長春堿衍生物雜質(zhì)分離在探尋硅膠TLC展開劑條件時,筆者觀察到,使用脫水和未經(jīng)脫水處理的甲醇,獲得的長春瑞濱與主要雜質(zhì)斑點的Rf比值(含一定水分)并不相同,后者比前者對長春瑞濱的洗脫能力更強,說明微量的水分存在下有利于長春瑞濱與雜質(zhì)的分離。相應(yīng)地,當(dāng)干柱分離粗樣品時,使用未經(jīng)活化處理的硅膠比經(jīng)105℃活化處理1h的硅膠對長春瑞濱與雜質(zhì)的分離效果稍好(結(jié)果未列出)。另外,不論是硅膠色譜還是在MCI-GELCHP-20柱或者C18柱(HPLC分離)上,長春瑞濱的保留值都較其他物質(zhì)大。這些都提示,對長春瑞濱和其結(jié)構(gòu)類似的伴生雜質(zhì)分離,更適合利用“反相分離”模式。以硫酸長春堿為原料,經(jīng)過脫水、溴代、縮環(huán)等步驟得長春瑞濱的反應(yīng)過程中,長春堿雙吲哚環(huán)上面的活性基團容易發(fā)生氧化水解等反應(yīng),主要生成以下幾種長春堿衍生物雜質(zhì):一是長春堿雙吲哚環(huán)上面的3個甲酯鍵極易發(fā)生水解,生成如4-O-deacetylvinorelbine(相對分子質(zhì)量為737)等去乙?；L春瑞濱;二是6′位的N原子發(fā)生氧化,生成氮氧化合物vinorelbin6′-oxide(6′-氧化長春瑞濱,相對分子質(zhì)量為795);三是20′位的C原子發(fā)生氧化,形成20′-hydroxyvinorelbine(20′-羥基長春瑞濱,相對分子質(zhì)量為795)。這幾種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與長春瑞濱極其相似,分子質(zhì)量相近,所以用一般的填料很難將這些雜質(zhì)與長春瑞濱高效率分離。另一方面,由于吲哚環(huán)上的酯鍵被水解為羥基,氮原子上形成了新的N—O鍵,這些雜質(zhì)的極性都略大于長春瑞濱。從理論上講,采用聚苯乙烯系列反相色譜系統(tǒng),應(yīng)該能得到較好的分離效果,本實驗良好的分離結(jié)果證實了這一推測。干柱柱色譜能省時省工,節(jié)約溶劑,利用它先將有機合成中的大部分極性較大的雜質(zhì)除去,可以降低后續(xù)分離對精細(xì)填料的損害,從而降低分離成本。在目前實際工業(yè)生產(chǎn)中,已經(jīng)發(fā)明了一種組合式色譜干柱裝置,解決了目前色譜