姜黃素不同給藥途徑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和絕對(duì)生物利用度研究

姜黃素不同給藥途徑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和絕對(duì)生物利用度研究

姜黃素是姜科天南星科植物的提取物。這是植物種類很少的第一種二醇色素。姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化、抗肝細(xì)胞毒性、抗風(fēng)濕、抑菌等廣泛的藥理作用。姜黃素在水中溶解度低,血漿半衰期很短,血藥濃度低,口服不易吸收,生物利用度低。而具有生物活性的化合物能否在生物體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng),很大程度上取決于血漿中藥物濃度和生物利用度。曾有文獻(xiàn)報(bào)道過姜黃素的口服生物利用度低,但缺乏其具體數(shù)據(jù)及其它給藥途徑的絕對(duì)生物利用度資料。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同給藥途徑下大鼠血漿中姜黃素的濃度,從而研究姜黃素的藥代動(dòng)力學(xué)過程,計(jì)算口服以及腹腔注射姜黃素的生物利用度,為姜黃素不同劑型的制備以及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料表面1.1g3a自動(dòng)進(jìn)樣器高效液相色譜儀為Agilent1100系列,包括G1322A在線脫氣機(jī),G1311A四元泵,G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A溫控箱,G1315B二極管陣列檢測(cè)器和Agilent化學(xué)工作站(RevB.08.04.)。電子分析天平(AB204-A,梅特勒-托利多上海儀器公司);渦旋混合器(XK96-B,姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);氮吹儀(D10型,杭州藍(lán)焰科技有限公司)。1.2實(shí)驗(yàn)用水及設(shè)備甲醇和乙腈為一級(jí)色譜純,三氟乙酸(Sigma,064K3647),乙酸乙酯、氫氧化鈉均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。姜黃素對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司,含量98.7%,070912);AF2364對(duì)照品(美國(guó)洛克菲勒大學(xué)提供,含量99.6%)。1.3動(dòng)物21只♂SD大鼠,體質(zhì)量(230±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。2方法2.1給藥方案2.1.1配制0.0.2%-1標(biāo)準(zhǔn)溶液灌胃給藥溶液:用5%DMSO-玉米油溶解,配制成200mg·kg-1混懸液,臨用前配制。靜脈給藥溶液:用10%DMSO-生理鹽水溶解,配制成10mg·kg-1澄清液,臨用前配制。腹腔注射給藥溶液:用10%DMSO-生理鹽水溶解,配制成20mg·kg-1澄清液,臨用前配制。2.1.2灌胃后不同給藥時(shí)間將21只大鼠隨機(jī)分成3組,給藥前每組均禁食12h(不禁水),分別舌下靜脈(10mg·kg-1)、灌胃(200mg·kg-1)和腹腔注射(20mg·kg-1)給藥。靜脈給藥后分別于5、8、10、15、20、25、35、45、60、120、180min尾靜脈取血;灌胃組分別于給藥后10、15、25、35、45、60、120、180、240、300、360min尾靜脈取血;腹腔注射組分別于給藥后10、15、25、35、45、60、120、180、240min尾靜脈取血。采血0.6ml注入肝素化的試管,離心(3000r·min-1)取血漿,-40℃冰凍保存?zhèn)錅y(cè)。2.2對(duì)照溶液的制備2.2.1姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備準(zhǔn)確稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品25mg于25ml容量瓶中,用甲醇溶解定容至25ml,得濃度為1g·L-1的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用甲醇稀釋成濃度依次為100、10、1mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液(臨用前稀釋)。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液af2364的制備準(zhǔn)確稱取AF2364標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品25mg于25ml容量瓶中,用甲醇溶解定容至25ml,得濃度為1g·L-1的AF2364標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用甲醇稀釋成濃度為100mg·L-1的AF2364內(nèi)標(biāo)工作溶液。2.3活性化合物的制備準(zhǔn)確吸取待測(cè)血漿樣品0.3ml于10ml具塞試管中,加入100mg·L-1的AF2364內(nèi)標(biāo)工作液50μl,混勻后加入0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液200μl。再加入乙酸乙酯3.0ml,漩渦混勻2min。轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一刻度離心管中,氮吹儀中吹干。用200μl流動(dòng)相復(fù)溶,取復(fù)溶液于自動(dòng)進(jìn)樣器的樣品瓶中,設(shè)定10μl進(jìn)樣檢測(cè)。2.4保護(hù)柱、流動(dòng)相、溫度色譜柱:ZORBAXSB-C18(4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA);保護(hù)柱:SB-C18保護(hù)柱(4.6mm×12.5mm,5μm,Agilent,USA);流動(dòng)相:乙腈∶水∶0.1%TFA=50∶30∶20(V/V/V);流速:1.0ml·min-1;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):302nm(0～5.5min),422nm(5.5～7.5min)。2.5數(shù)據(jù)分析采用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件處理血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù),得到姜黃素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),并計(jì)算其腹腔注射和口服的絕對(duì)生物利用度。3標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限空白血漿、姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)品以及大鼠血漿樣品,經(jīng)HPLC分析測(cè)定得到的色譜圖見Fig1。由圖可見在本實(shí)驗(yàn)條件下,姜黃素與內(nèi)標(biāo)能完全分離,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾姜黃素和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè);姜黃素的保留時(shí)間為6.7min,內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為4.4min。A:Blankplasma;B:Plasmaspikedwithcurcumin(4mg·L-1)andinternalstandard;C:Ratplasmasample0.5hafterintravenouslyinjection(0.565mg·L-1);1:internalstandard;2:curcumin配成濃度相當(dāng)于0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00mg·L-1的姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,再按“2.3”項(xiàng)處理后檢測(cè),測(cè)定姜黃素峰面積As、內(nèi)標(biāo)峰面積Ai,以As/Ai為縱坐標(biāo)(Y),以所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度C為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y?=0.3186X?0.0012(r=0.9998)Y^=0.3186X-0.0012(r=0.9998)。定量下限為0.05mg·L-1(n=6;RSD=5.21%)。3.3凍融條件對(duì)血漿中姜黃素的檢測(cè)配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每種濃度6份,再按“2.3”項(xiàng)處理后檢測(cè)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的濃度,低、中、高3種濃度的相對(duì)回收率分別為(99.29±5.40)%、(104.21±4.72)%、(99.83±1.97)%。配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每種濃度6份,再按“2.3”項(xiàng)處理后檢測(cè),記錄姜黃素的峰面積,為血漿標(biāo)準(zhǔn)的峰面積。另取錐底試管6支,兩個(gè)一組;每組加入與配制血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,直接吹干后用流動(dòng)相200μl復(fù)溶,10μl進(jìn)樣檢測(cè);記錄不同濃度姜黃素的峰面積,為該濃度的純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。計(jì)算血漿標(biāo)準(zhǔn)的峰面積與純標(biāo)的峰面積的比值,即為絕對(duì)回收率,絕對(duì)回收率分別為(77.18±3.48)%、(77.84±1.22)%、(78.25±0.81)%。配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每種濃度6份,再按“2.3”項(xiàng)處理后于同一日內(nèi)測(cè)定,依據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)量,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)3d同樣操作,計(jì)算日間精密度。結(jié)果上述方法測(cè)得的日內(nèi)和日間RSD均小于10%,符合生物分析方法指導(dǎo)原則的要求。配制低、中、高3個(gè)濃度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種濃度3份;經(jīng)歷3次冰凍-解凍循環(huán)后,按“2.3”項(xiàng)處理檢測(cè),考察其穩(wěn)定性。低、中、高3個(gè)濃度的RSD分別為4.92%、4.56%、0.65%,結(jié)果顯示凍融條件對(duì)血漿樣品的檢測(cè)結(jié)果沒有明顯的影響。7只大鼠單劑量iv10mg·kg-1姜黃素后,血藥濃度-時(shí)間曲線見Fig2A;7只大鼠單劑量ip20mg·kg-1姜黃素后,血藥濃度-時(shí)間曲線見Fig2B;7只大鼠單劑量ig200mg·kg-1姜黃素后,血藥濃度-時(shí)間曲線見Fig2C。血漿藥物濃度經(jīng)DAS程序處理,姜黃素在大鼠體內(nèi)iv、ip和ig給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見Tab1。并根據(jù)下式計(jì)算姜黃素在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度:F/%=(AUC血管外給藥·D靜脈注射)/(AUC靜脈注射·D血管外給藥)×100%。經(jīng)計(jì)算姜黃素在大鼠體內(nèi),口服給藥絕對(duì)生物利用度為4.13%,腹腔注射給藥的絕對(duì)生物利用度為35.07%。關(guān)于血漿姜黃素的檢測(cè),一般采用HPLC-UV的方法。姜黃素在整個(gè)紫外區(qū)均有良好的吸收,二極管陣列檢測(cè)器(DAD)三維立體圖顯示,姜黃素的最大吸收波長(zhǎng)在426nm處。本研究使用AF2364做內(nèi)標(biāo),最大吸收波長(zhǎng)在302nm處,故采用DAD波長(zhǎng)梯度的功能,在0～5.5min使用302nm波長(zhǎng)檢測(cè)AF2364,5.5～7.5min使用426nm波長(zhǎng)檢測(cè)姜黃素,獲得了良好的色譜峰。通過靜脈注射、腹腔注射和灌胃3種給藥途徑藥動(dòng)學(xué)結(jié)果來(lái)看,姜黃素靜脈給藥后,大鼠體內(nèi)代謝迅速。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素靜脈給藥的消除半衰期為(11.96±2.64)min,與灌胃給藥的消除半衰期(90.79±11.55)min、腹腔注射給藥的消除半衰期(159.28±18.12)min差異均有顯著性(P<0.05)。同時(shí)從藥時(shí)曲線分布相可知,靜注后血藥濃度幾分鐘內(nèi)就迅速下降了幾倍,這可能是姜黃素經(jīng)靜注后迅速向各臟器分布。大鼠分別經(jīng)灌胃(200mg·kg-1)、腹腔注射(20mg·kg-1)、舌下靜脈(10mg·kg-1)給予姜黃素后,其Cmax分別為(3.58±0.58)mg·L-1、(1.01±0.12)mg·L-1、(0.67±0.06)mg·L-1,可以為姜黃素在不同給藥途徑下的藥效學(xué)研究提供給藥劑量的參考。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,口服姜黃素的生物利用度達(dá)4.13%,腹腔注射姜黃素的生物利用度為35.07%,與文獻(xiàn)報(bào)道,姜黃素大鼠口服吸收很低一致。腹腔給藥后,部分姜黃素未被吸收,可能與腹腔內(nèi)的血流量有關(guān),也可能是非水溶液在腹腔內(nèi)局部滯留、吸收緩慢;腹腔給藥后的AUC明顯大于灌胃給藥AUC,說明姜黃素口服后極少原形