滇蜀沉淀植物的is序列構(gòu)建

滇蜀沉淀植物的is序列構(gòu)建

豹子花是云南的八大花之一，屬于百合科和虎丘花。本屬有8種1變種和1變型,可分為細(xì)絲組和豹子花組。每一種豹子花屬植物在云南都有分布,且該屬內(nèi)大部分種類為云南特有種,如開瓣豹子花(Nomocharisaperta)為云南特有種,而美麗豹子花(N.basilissa)、碧黑豹子花(N.biluoensis)、滇西豹子花(N.farreri)、寬瓣豹子花(N.mairei)除了在緬甸北部有少量分布外,則只在我國境內(nèi)的云南省西北部有分布。該屬與百合屬中的某些種類親緣關(guān)系密切,有分類學(xué)家曾把開瓣豹子花(Nomocharisaperta)和云南豹子花(Nomocharissaluensis)放在百合屬中,而百合屬中的紫花百合(Liliumsouliei)則有學(xué)者認(rèn)為是豹子花屬的成員。關(guān)于豹子花屬植物細(xì)胞核型和花粉形態(tài)學(xué)的研究已有報道,對本屬植物染色體核型和花粉形態(tài)在分類上的差異進(jìn)行了研究,而分子水平上的研究尚未見報道,本研究旨在利用ITS序列從分子的角度來分析豹子花屬內(nèi)各種以及該屬與百合屬內(nèi)一些地理分布接近的各個種的差異,探討豹子花屬與百合屬內(nèi)部分種的親緣關(guān)系,為該屬的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供一些分子理論依據(jù)。1材料和方法1.1不同擄測花及親緣關(guān)系分析所用材料為滇蜀豹子花(N.forrestii)和多斑豹子花(N.meleagrina),滇蜀豹子花采自云南中甸海拔3100m的草叢中;多斑豹子花采自云南貢山海拔3100m的樹林邊緣;此外,從GenBank中搜尋了其它3種豹子花和5種百合的ITS序列參與親緣關(guān)系分析,5種百合中以紫斑百合和大理百合為外類群。材料編號和下載序列的序列號見表1。1.2方法1.2.1pcr擴增體系取滇蜀豹子花和多斑豹子花的新鮮葉片,用CTAB法提取總DNA。ITS序列以通用的ITS測序引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進(jìn)行雙向擴增。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min,然后以94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸50s,循環(huán)30次,再以72℃保溫7min,最后在4℃保存。反應(yīng)體系為20μL,其中含有:Taq酶1U,1.5mmol·L-1MgCl2(Taq酶配套),125μmol·L-1dNTPs(上海生工),2個引物各0.05μmol·L-1(上海生工),1μLDMSO(上海生工,AMRESCO進(jìn)口分裝),20ng模板DNA,1×PCR反應(yīng)Buffer(Taq酶配套)。反應(yīng)在iCyclerTMThermalCycler擴增儀(BIO-RAD公司)進(jìn)行,得到的PCR產(chǎn)物交由上海生工測序公司進(jìn)行純化和測序。1.2.2dna序列的排列和人工處理將測序得到的滇蜀豹子花和多斑豹子花的ITS雙向序列用DNASTAR商用軟件包SeqMan進(jìn)行序列拼接,截去測序引物及頭尾多余序列。所得DNA序列經(jīng)ClustalX1.8進(jìn)行多重對比排列,并采用人工處理的方法做進(jìn)一步調(diào)整。再以GenBank中的該屬其它物種的序列作比對,用ClustalX軟件比對后去頭截尾,得到2種植物的ITS序列。對表1中的序列用系統(tǒng)發(fā)育軟件MEGA2.1(molecularevolutiongeneticanalysis,version2.1)進(jìn)行序列數(shù)據(jù)計算和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。2結(jié)果與分析2.1百合系植物的進(jìn)化序列及序列特征把得到的滇蜀豹子花和多斑豹子花的ITS序列與其它幾種豹子花序列比對,確定這兩種植物的ITS1、5.8S和ITS2序列的長度。ITS區(qū)和分區(qū)長度及G+C含量變異見表2。這些豹子花屬植物ITS序列長度變化不大,不存在插入與缺失,除了怒江豹子花是625bp之外其余4種都是626bp,5種豹子花的ITS1長度均為229bp,5.8S長度均為163bp,ITS2長度除怒江豹子花是233bp外,其余4種是234bp。本實驗所選的5種百合屬植物包括作為外類群的紫斑百合和大理百合在ITS序列的長度上與豹子花屬植物幾乎一致,除墨江百合ITS2區(qū)有235bp外,其它幾種百合ITS序列長度均與豹子花屬5種植物的長度一致。豹子花屬植物ITS序列的G+C含量在60.38%～61.12%之間。兩屬共10種植物5.8S區(qū)的G+C含量都低于ITS1、ITS2兩個轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),除大理百合外其余9種植物5.8S的G+C含量較為接近,其中滇蜀豹子花、怒江豹子花與尖被百合3個種的值相同,均為54.60%,余下的6種植物5.8S的G+C含量都是55.21%,這說明該區(qū)段在進(jìn)化上具有很大保守性。10種植物ITS1G+C含量略低于ITS2或與ITS2相當(dāng)。從表2中可看出包含紫斑百合在內(nèi)的9種植物ITS1G+C含量變化范圍為60.26%～62.01%,ITS2G+C含量變化范圍為62.82%～65.66%。5種豹子花屬植物在整個ITS區(qū)共有變異位點574個(表3),其中ITS1、5.8S和ITS2的變異位點分別為27、2和23個。5.8S的變異位點最少,這說明5.8S保守性較強,ITS區(qū)的變異主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1、ITS2)。在ITS區(qū)提供的信息位點中,信息位點只存在于ITS1和ITS2,并且ITS1的信息位點數(shù)較ITS2多?？紤]到5.8S過于保守,而單獨的ITS1或ITS2片段所提供的信息量不足,因此,后面將ITS1、ITS2和5.8SrDNA綜合在一起分析。2.2不同聚類分析將對位排列后的序列導(dǎo)入MEGA2.1軟件,選擇Kimura2-paramenter核酸距離模式計算得遺傳距離矩陣(表4)。豹子花屬5種植物的遺傳距離在0.010～0.070之間。用算術(shù)平均不加權(quán)組對法(UPGMA),鄰接法(NJ),最小進(jìn)化法(ME)和最大簡約法(MP)對10種植物進(jìn)行聚類分析,所得系統(tǒng)樹見圖1。4種聚類圖總的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大體相同,NJ樹、ME樹和MP樹幾乎完全一致,只是對某些種類的分辨率和自展支持率有所差別。UPGAM樹(圖1,A)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其它3種方法(圖1,B～D)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相比存在一定差異。考慮到當(dāng)基因替代率不穩(wěn)定且所用的基因或核苷酸數(shù)目較小時,使用UPGAM法經(jīng)常出現(xiàn)拓?fù)鋵W(xué)誤差,所以本實驗選用鄰接法、最小進(jìn)化法和最大簡約法作為討論依據(jù),UPGAM法僅供參考。MP樹(圖1,D)樹長為171,一致性指數(shù)(CI)為0.7602,保持性指數(shù)(RI)為0.6058。從圖1,A的聚類結(jié)果來看,怒江豹子花分離出了豹子花屬的支系,與百合屬的5個種聚在一起,但這個分支只有44%支持率,與其它3種聚類樹有顯著差別。這可能是由UPGAM法的拓?fù)鋵W(xué)誤差造成的。NJ(圖1,B)樹和ME(圖1,C)樹在分支形狀上完全一致,只是各條分支的支持率稍有差別。在這2種聚類樹中,首先是多斑豹子花和怒江豹子花聚為1支,然后與滇蜀豹子花聚在一起形成第2支,滇西豹子花與豹子花以100%的支持率(NJ樹)聚在一起聯(lián)合第2支成為第3個分支,由墨江百合、尖被百合、小百合等聚成了第4大支,在這一大支中,尖被百合先與小百合聚在了一支,而且還獲得了非常高的支持率(NJ樹97%,ME樹96%,MP樹92%),然后再與墨江百合聚成第4大支。紫斑百合與第4支相聚成為第5大分支,說明紫斑百合與豹子花屬親緣關(guān)系較大理百合與豹子花屬近。3tables序列聚類分析滇蜀豹子花和多斑豹子花的ITS序列總長度(626bp)和各區(qū)段長度(ITS1區(qū)229bp,5.8S區(qū)163bp,ITS2區(qū)234bp)相同,與GenBank中下載的滇西豹子花,豹子花以及百合屬的尖被百合、小百合、紫斑百合、大理百合的ITS序列總長度和分區(qū)長均一致,而怒江豹子花和墨江百合只有ITS1區(qū)和5.8S的長度與前述的8種植物相同,在ITS2區(qū)段長度分別為233bp和235bp,比這8種植物分別少了1個堿基和多了1個堿基。該結(jié)果與趙玥等認(rèn)為被子植物核rDNA的ITS區(qū)中,5.8SrDNA的長度非常保守,一般為163bp或164bp的觀點相符。同時也說明ITS序列長度具有一定保守性,即便是在同科不同屬的植物之間也不會差異太大,至少本研究分析的豹子花屬與百合屬10種植物符合這種觀點。聚類分析得到的UPGMA樹與NJ樹、MP樹、ME樹在怒江豹子花的分支聚類上有差別,這可能是由于UPGMA方法在構(gòu)樹時,如果存在基因替代率不穩(wěn)定且所用的基因或核苷酸數(shù)目較小時,會出現(xiàn)拓?fù)鋵W(xué)誤差。另外,由于有同源序列的平行進(jìn)化時UPGMA樹常得出錯誤的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),以UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)樹很可能與真實結(jié)構(gòu)有較大偏差。本研究采用ITS序列作為分析對象,ITS序列長度通常短于其他種類的序列,如葉綠體基因片段序列,此外由于本研究分析的物種數(shù)量偏少,因此,分析時UPGMA樹只作為一個聚類參考,而分支走向完全一致的NJ樹、ME樹、MP樹作為豹子花屬植物親緣關(guān)系的主要依據(jù)。在NJ樹、ME樹、MP樹中,都是豹子花屬的5個種先聚在一起,再與百合屬的5個種相聚。5種百合中的墨江百合、尖被百合、小百合與豹子花屬植物在分布海拔和區(qū)域上有部分重合,并且形態(tài)上也與豹子花屬植物相似。在已報道的文獻(xiàn)中,前述3種百合分類上與豹子花屬有千絲萬縷的聯(lián)系,而本研究ITS序列聚類分析的結(jié)果也證實了這3種百合與豹子花屬的關(guān)系密切。如墨江百合在NJ樹和ME樹中成為聯(lián)系豹子花屬與百合屬的紐帶,《云南植物志》中稱其為怒江百合,形態(tài)特征被描述為與豹子花屬植物較一致,可歸入豹子花屬。滇西豹子花與豹子花在NJ、MP和ME3個聚類樹中都以99%或100%的支持率首先相聚在一起,說明這2個種的親緣關(guān)系較近。并且,在《中國植物志》中,滇西豹子花被劃為豹子花的一個變種,但是《云南植物志》中記錄的滇西豹子花特征是內(nèi)輪花被片僅具淺齒或常全緣,與豹子花有明顯區(qū)別,所以應(yīng)該保留其種的等級。作為外類群的大理百合分布海拔比豹子花屬植物及其它4種百合稍低,屬于中低海拔分布的種類,上述的G+C含量分析和聚類圖分支都顯示出大理百合與本研究所涉及的另外9種植物差異較大,即使是與同為卷瓣組的紫斑百合相比也是如此,這可能是由遺傳差異造成的生態(tài)適應(yīng)性上差別。Tomotaro等以64種百合屬植物為材料,怒江豹子花為外類群做過ITS序列分析,認(rèn)為紫斑百合與怒江豹子花親緣關(guān)系更近,與同一屬內(nèi)的墨江百合親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與本研究中紫斑百合與墨江百合遺傳距離最近,怒江豹子花與屬內(nèi)的其他豹子花親緣關(guān)系更近的聚類結(jié)果有較大差異,這可能是研究材料不全面造成的結(jié)果。由于每位研究者獲得的研究材料都會受到種種因素限制,所以得到的研究結(jié)果難免會有一定的局限性。而本研究僅從ITS序列的差異角度揭示了豹子花屬5種植物和百合屬5種植物間的親緣關(guān)系,ITS序列只是核基因組中眾多序列中的一種,所以文中結(jié)論還需要有其他方面的證據(jù),如細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)等方面數(shù)據(jù)來支持。此外,前人研究認(rèn)為豹子花是隨著青藏高原迅速上升過程中在劇烈變化的自