分子遺傳學(xué)課件-遺傳多態(tài)性

2023/10/4

2歡迎同學(xué)們學(xué)習(xí)《分子遺傳學(xué)》分子遺傳學(xué)教師：劉若余聯(lián)系電話13984812913基因組多態(tài)性基因組多態(tài)性：在不同群體或個體之間，基因組的某些位點上堿基的差異。這種差異也稱之為分子遺傳標記。遺傳標記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征在經(jīng)典遺傳學(xué)中,遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異.在現(xiàn)代遺傳學(xué)中,遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異.

DNA分子標記是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映.DNA水平的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異,哪怕是單個核苷酸的變異.因此,DNA標記在數(shù)量上幾乎是無限的.DNA遺傳標記特點：1.直接反映基因特征，非推測。2.基因座位數(shù)量多，無論表達與否。3.多態(tài)性程度高，等位基因多，鑒別能力強。4.適合于陳舊的樣品，檢測能力強。5.靈敏度高，有利于微量樣品的檢測。6.易于檢測手段的自動化、標準化，重復(fù)性好。逐漸取代了蛋白質(zhì)水平的檢測方法。DNA多態(tài)性的分類

1）長度多態(tài)性：等位基因片段長度的個體差別。由一特定序列，首尾相連串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同產(chǎn)生的個體差別?？勺償?shù)目串聯(lián)重復(fù)（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)A：產(chǎn)生原因：DNA滑動與同源染色體不等交換。2）序列多態(tài)性：DNA片段堿基排列順序的個體差別。單核苷酸多態(tài)性（singleucleotidepolymorphism,SNPs）原因：堿基的置換、插入、缺失。特點：多位于非編碼區(qū)，選擇壓力。數(shù)量多，1/1000bp，300萬二態(tài)性，2個等位基因，多態(tài)性程度較低。孤立事件，人類遺傳學(xué)意義大。DNA標記的分類依據(jù)多態(tài)性的檢測手段,DNA標記可分為四大類:(1)基于DNA-DNA雜交的DNA標記.

該標記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子,然后用經(jīng)標記的DNA探針,通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性.其中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早和應(yīng)用廣泛的RFLP標記.(2)基于PCR的DNA標記.

根據(jù)PCR所用的引物特點,這類DNA標記可分為隨機引物PCR標記和特異引物PCR標記.隨機引物PCR標記包括RAPD標記和ISSR等,隨機引物PCR所擴增的DNA區(qū)段事先未知,具有隨意性和任意性,因此隨機引物PCR標記技術(shù)可用于對任何未知基因組的研究.特異引物PCR標記包括SSR標記和STS標記等,特異引物PCR所擴增的DNA區(qū)段事先是已知的明確的,具有特異性.因此特異引物PCR標記技術(shù)依賴于對各個物種基因組信息的了解.(3)基于PCR和限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標記.這類DNA標記可分為二種類型,一種是通過對限制性酶切片段的選擇性擴增來顯示限制性片段長度的多態(tài)性,如AFLP標記.另一種是通過對PCR擴增的片段的限制性酶切來揭示被擴增的區(qū)段的多態(tài)性,如CASP標記.4)基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標記,如SNP標記.單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記被稱為第三代分子標記。它也是以以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)?；谶z傳標記的發(fā)展歷程第一代標記經(jīng)典的遺傳標記（蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標記）

70年代中后期，限制酶片段長度多態(tài)性（RFLP）第二代標記

85年，“小衛(wèi)星序列"（minisatellite）89年，“微衛(wèi)星序列"（microsatellite）第三代標記單核苷酸多態(tài)性標記（singlenucleotidepolymorphism，SNP）經(jīng)典的遺傳標記（蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標記）ABO血型位點標記HLA位點標記（人類白細胞抗原）存在問題：已知多態(tài)的蛋白質(zhì)很少等位基因的數(shù)目有限無法獲得足夠的信息量檢測技術(shù)的繁瑣等—限制了人類基因組的遺傳分析工作—促使人們直接在DNA上尋找遺傳標記遺傳標記中的第一代標記蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標記同工酶的多態(tài)性EsD分型示意圖遺傳標記中的第一代標記RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)標記技術(shù)

RFLP即限制性片段長度多態(tài)性.是指用某一種限制性內(nèi)切酶來切割來自不同個體的DNA分子上，內(nèi)切酶的識別序列有差異，即是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的。這種差異反映在酶切片段的長度和數(shù)目上。

限制性內(nèi)切酶是一種能識別DNA上特定堿基組成的序列,并在這些序列位點上切斷DNA分子的酶.限制性片段長度多態(tài)性的DNA基礎(chǔ)（1）

識別部位的點突變：堿基的替換、修飾（甲基化）或插入與缺失。（2）

識別部位間的片段插入與缺失。（3）

識別部位間的重復(fù)序列數(shù)目的變化。

DNA限制性內(nèi)切酶restrictionendonuclease

能夠識別特定的DNA序列，與DNA分子結(jié)合后在特定部位將DNA雙鏈切斷的核酸水解酶。（1）生物學(xué)功能：水解核酸的磷酸二酯鍵。（2）命名：根據(jù)微生物的種（第一個字母大寫）、屬（前二個字母小寫）、變種第一個字母大寫）、發(fā)現(xiàn)分離的順序（羅馬數(shù)字）。（3）分類：A：Ⅰ型：遠離識別部位隨即切割，非特異。B：Ⅱ型：在識別部位內(nèi)部切割，特異。C：Ⅲ型：在識別部位后定點切割，特異。單位：1U：在標準條件下，1h完全水解1μgλ噬菌體的酶量。Ⅱ型DNA限制性內(nèi)切酶：

A：識別核酸序列數(shù)目4-6個。B：識別序列為回紋序列。C：切割后產(chǎn)生的末端分為粘行末端與平末端。例：PstⅠ5ˊ-C↓TGCAG-3ˊ3ˊ-GACGT↑C-5ˊHaeⅢ5ˊ-GG↓CC-3ˊ3ˊ-CC↑GG-5ˊ分型法：

RFLP標記是發(fā)展最早的DNA標記技術(shù)。RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：DNA提取用限制性內(nèi)切酶酶切DNA、用凝膠電泳分開DNA片段把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上利用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結(jié)果分析。特點A無表型效應(yīng)，RFLP標記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。BRFLP標記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。C在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾DRFLP標記起源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制EDNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實踐中。在植物分子標記輔助育種中需要將RFLP轉(zhuǎn)換成以PCR為基礎(chǔ)的標記。PCR-RFLPPCR-RFLPAnalysisTT:55+68+135+241+302bpCT:55+68+135+241+302+543bpCC:55+68+135+543bp

AA:152+187+462bpCA:83+104+152+187+462bpCC:83+104+152+462bp微衛(wèi)星標記技術(shù)真核生物基因組中廣泛存在著串聯(lián)重復(fù)序列。根據(jù)重復(fù)單位大小的不同，將重復(fù)序列分為三類：衛(wèi)星序列、小衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星序列。衛(wèi)星DNA:序列重復(fù)單位的長度最常見的是100~300bp,有時可達幾千bp,這些基元的拷貝數(shù)是1000~100000,形成很長的成串的重復(fù)結(jié)構(gòu).通常存在于異染色質(zhì)，主要分布在著絲粒區(qū)域。小衛(wèi)星DNA:是一些重復(fù)單位在10~60bp,總長度由幾百到幾千個bp串聯(lián)重復(fù)序列,它主要存在于近端粒處,在不同的個體間存在著串聯(lián)數(shù)目的差異,表現(xiàn)出高度的個體特異性,且以孟德爾方式穩(wěn)定地遺傳和分離,通常又被稱為DNA指紋.該類可通過RFLP的方法加以鑒別.簡單序列重復(fù)標記，SSR又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satelliteDNA)標記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元2~6bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個位點。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果SSR標記的主要特點（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費用也較高。微衛(wèi)星DNA多態(tài)形成的機制

微衛(wèi)星位點由其核心序列(coresequence)和兩側(cè)的側(cè)翼序列(flankingsequence)共同構(gòu)成,側(cè)翼序列具有位點特異性,而微衛(wèi)星本身的重復(fù)數(shù)變異則提供了微衛(wèi)星位點產(chǎn)生多態(tài)性的基礎(chǔ).重復(fù)數(shù)越大,其變異性也越大,等位基因數(shù)也越多.引起微衛(wèi)星位點發(fā)生突變的原因主要為“滑鏈錯配”（slipped-strandmispairing)。在DNA復(fù)制合成的過程中，新生鏈和模板鏈之間在微衛(wèi)星重復(fù)區(qū)域可能發(fā)生錯配，使得一個或者幾個重復(fù)單位形成環(huán)狀，未能參與配對。如果未配對的重復(fù)單位位于新生鏈，則最終得到的新生鏈未配對重復(fù)單位數(shù)目比模板鏈多。反之，如果未配對的重復(fù)單位位于模板鏈，則最終得到的新生鏈未配對重復(fù)單位數(shù)目比模板鏈少.微衛(wèi)星的檢測1．基因組DNA制備2．微衛(wèi)星DNA的擴增：反應(yīng)總體積為25μL3．SSR標記電泳檢測：分3個主要環(huán)節(jié)。1）電泳：

采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,設(shè)恒定功率,預(yù)電泳約30min后,加擴增樣品DNA4～6μL,電泳40～60min(視ＳＳＲ分子量大小及