microrna與相關(guān)分子機(jī)制的研究進(jìn)展

microrna與相關(guān)分子機(jī)制的研究進(jìn)展

mirna是一種廣泛存在于真核生物中的微分子非編碼rna，由大約22個(gè)乙酸組成。它由發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70～90個(gè)堿基大小的單鏈pre-miRNA經(jīng)過(guò)酶切加工后生成。其功能主要是通過(guò)降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯兩種作用方式來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。miRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、早期診斷和患者預(yù)后密切相關(guān):(1)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),Feber等人研究結(jié)果提示miR-203和miR-205的表達(dá)下調(diào)以及miR-21表達(dá)上調(diào)可能和食管癌發(fā)生,而相關(guān)研究顯示miR-205參與食管鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲;(2)與診斷相關(guān),血漿中的miR-210和miR-141分別是胰腺癌和前列腺癌臨床診斷的指標(biāo)。miR-9和miR-223是卵巢癌復(fù)發(fā)的標(biāo)記;(3)與預(yù)后相關(guān),高表達(dá)的hsa-mir-155和的miR-210在胰腺癌發(fā)揮著重要的作用并與預(yù)后有著密切的關(guān)系。miRNA表達(dá)的檢測(cè)方法從傳統(tǒng)的Northernblotting檢測(cè)方法到高通量miRNAChip的檢測(cè)發(fā)展過(guò)程,從原理上可以兩類,一類是探針雜交方法,另一類是擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法。1pcr檢測(cè)nanorna表達(dá)Northernblotting法是經(jīng)典的基于固相探針雜交技術(shù),其原理:在變性的條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè),了解microRNA表達(dá)差異。它是驗(yàn)證microRNA表達(dá)最廣泛且有效的方法;而且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易行。但缺點(diǎn)是所需樣品量大,特異性也不高。2mirna表達(dá)譜microRNA芯片是一種更快、更廣泛、更有前途的研究miRNA表達(dá)的方法,是在一塊芯片上同時(shí)固定多個(gè)與miRNA序列互補(bǔ)的探針,然后加入經(jīng)過(guò)標(biāo)記的樣本RNA,雜交后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè),并且可以在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)鑒定所有已知小RNA的表達(dá)譜。此技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是高產(chǎn)出、高靈敏度、高特異性、可以實(shí)現(xiàn)miRNA的高通量分析,短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)全基因組miRNA表達(dá)譜;缺點(diǎn)是費(fèi)用高,信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較差,無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Wong等應(yīng)用microRNA芯片的表達(dá)譜研究分析了HCC(肝癌)細(xì)胞中miRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)HCC中miR-223表達(dá)下調(diào),揭示miR-223可能發(fā)揮著抑制HCC的發(fā)生。MariaJ等人研究造血系統(tǒng)腫瘤miR-203表達(dá)降低,其原因是由于14號(hào)染色體的缺失和啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致。Lu等檢測(cè)217種miRNA在不同早期腫瘤及其衍生細(xì)胞和不同正常組織的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)癌組織有不同的miRNA表達(dá)譜,不同的癌組織有不同的miRNA表達(dá),從而為腫瘤的診斷和預(yù)后提供重要依據(jù)。此方法可用于檢測(cè)細(xì)胞、新鮮組織和福爾馬林固定石蠟包埋組織中miRNA的表達(dá)差異。3多色微球液相芯片法為克服基因芯片的弱點(diǎn),出現(xiàn)了新一代生物芯片技術(shù)即微球雜交的流式細(xì)胞檢測(cè)法(Beadbasedhybridizationtechnology),為高通量的新一代分子診斷技術(shù)提供平臺(tái)。微球雜交的流式細(xì)胞檢測(cè)法是構(gòu)成一個(gè)液相芯片系統(tǒng)的方法,多色微球液相芯片是由微小的聚苯乙烯粒子組成的微球,它結(jié)合了兩種不同顏色的熒光染料(紅色和橙色),當(dāng)微球被635nm的激光照射后,能發(fā)射658nm和712nm的熒光。比較二者發(fā)射光的比率,最多能夠區(qū)分100種不同的熒光微球。運(yùn)用精密的流式細(xì)胞技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理器和先進(jìn)的激光技術(shù),根據(jù)事先確定的熒光發(fā)射比率來(lái)鑒定出每一種不同顏色的微球,其優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)同一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析,應(yīng)用面廣泛,并且可以避免與基因芯片中的交叉反應(yīng),價(jià)格也便宜。HuangXH應(yīng)用該技術(shù)顯示12種microRNA表達(dá)上調(diào)和19種microRNA表達(dá)下調(diào),提示miRNA的表達(dá)與肝癌的臨床行為相關(guān)。4通插裝劑lna探針鎖定核苷酸的原位雜交與一般原位雜交實(shí)驗(yàn)原理相同。其優(yōu)點(diǎn):(1)修飾后的寡核苷酸探針與互補(bǔ)的RNA結(jié)合后具有很好的雙鏈穩(wěn)定性,從而避免小RNA在雜交洗脫過(guò)程中易丟失的情況,LNA是一種雙環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA類似物,其核糖磷酸骨架上的呋喃環(huán)通過(guò)一個(gè)N型糖苷鍵被鎖定;(2)LNA探針具有高靈敏性以及其與靶分子結(jié)合的高穩(wěn)定性等特點(diǎn),不僅檢測(cè)小RNA,還進(jìn)一步擴(kuò)展研究小RNA的干擾;(3)探針具有高靈敏度、高特異性特征,可覆蓋所有已知的miRNAs。HaijiaoYan等人研究發(fā)現(xiàn),miRNA-20a在胰腺癌組織比在正常胰腺組織中表達(dá)要低,提示其可能與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)。WeiRui等人應(yīng)用此技術(shù)檢miR-203在皮膚中的表達(dá)可以鑒定其組織層次,同時(shí)DmitriLodygin等人應(yīng)用此方法發(fā)現(xiàn)miR-34a在前列腺癌中表達(dá)水平降低。5基于pcr的檢測(cè)方法5.1未知模板定量分析realtimeRT-PCR是驗(yàn)證microRNA芯片數(shù)據(jù)的金標(biāo)準(zhǔn),可以對(duì)miRNA表達(dá)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,其實(shí)驗(yàn)原理:PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。此法優(yōu)點(diǎn)是高特異性、高靈敏度和高精確度并可以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,污染機(jī)會(huì)少。唯一不足的是費(fèi)用昂貴。TiliE和MichailleJJ等人檢測(cè)大鼠心、肝和大腦皮層中miR-155、miR-125b的表達(dá),驗(yàn)證了此法的可靠性。Bandres等應(yīng)用此方法檢測(cè)結(jié)腸癌癌組織中miR-31、miR-96、miR-133b表達(dá)下調(diào),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-31與腫瘤分期有關(guān)。RyoOgawa也在食管鱗癌中檢測(cè)了73個(gè)miRNAs,其中有6個(gè)高表達(dá)包含miR-34b/c的miRNA與預(yù)后不良有關(guān)。Li等人研究證實(shí)miRNA可以用來(lái)鑒別HCC(肝細(xì)胞癌)、非肝細(xì)胞腫瘤和正常肝臟組織,為臨床診斷提供一定的依據(jù)。5.2兩種rna的對(duì)比RT-PCR是檢測(cè)miRNA表達(dá)的常用實(shí)驗(yàn)方法,是一種常用、簡(jiǎn)潔、快速、特異、相對(duì)定量的RNA檢測(cè)技術(shù)。目前RT-PCR優(yōu)點(diǎn):(1)只需少量RNA,操作過(guò)程簡(jiǎn)單,可在較短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果,高通量,還可同時(shí)檢測(cè)多種miRNA及其對(duì)應(yīng)的pre-miRNA的表達(dá),且不用放射性同位素標(biāo)記;(2)可檢測(cè)成熟的microRNA,也可檢測(cè)單microRNA和siRNA。缺點(diǎn)是不能定量檢測(cè)。akao等人研究發(fā)現(xiàn),miR-143、miR-145和miR-let-7在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于結(jié)腸正常組織,提示以上miRNAs可能發(fā)揮抑癌基因的作用。5.3mirna在乳腺癌疾病中的表達(dá)StemloopRT-PCR技術(shù)包括設(shè)計(jì)具有莖環(huán)(stemloop)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物。應(yīng)用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針,不僅可以檢測(cè)成熟的miRNA,而且可用于其他小分子RNA的檢測(cè),如siRNA。其缺點(diǎn)是需要較昂貴的實(shí)驗(yàn)材料及儀器。UlrichLehmann檢測(cè)319種microRNA在9個(gè)男性乳腺腫瘤樣本和15個(gè)男性乳腺發(fā)育樣本中的表達(dá)情況,其中miR-21、miR-519d、miR-197、miR-493-5p表達(dá)上調(diào),而miR-145、miR-497表達(dá)下調(diào),揭示miRNA在乳腺疾病中發(fā)揮著重要的作用。Zhang等測(cè)定32例胃癌樣本中l(wèi)et-7miRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào),進(jìn)一步揭示let-7microRNA干預(yù)了胃癌的發(fā)生過(guò)程。6pcr檢測(cè)mirna的方法基于探針雜交技術(shù)的方法除了Northernblotting和miRNA芯片和基于微球雜交的檢測(cè)方法外,還有橋連同位素標(biāo)記技術(shù)和納米金標(biāo)記法等。納米金銀染增強(qiáng)技術(shù),是一種定量檢測(cè)miRNA表達(dá)的方法,該法通過(guò)吸光值定量檢測(cè)miRNA,通過(guò)納米金催化的銀染信號(hào)來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)?；跀U(kuò)增技術(shù),除了定量PCR外,還有滾環(huán)擴(kuò)增法、引物入侵法和克隆測(cè)序法等。滾環(huán)擴(kuò)增法由于有較高的擴(kuò)增效率,通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物與鎂離子生成白色沉淀物來(lái)初步判斷組織樣本中是否存在miRNA?？蒲腥藛T在檢測(cè)miRNA方面有了更多的方法,但在實(shí)驗(yàn)和臨床中應(yīng)用還不能普及,需要結(jié)合各自具體的實(shí)