大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

隨著老年人口的增加，骨質(zhì)疏松癥已成為老年人面臨的主要疾病之一，骨質(zhì)疏松癥的治療和預(yù)防研究日益受到重視。如何選擇合適的骨骼松弛動物模型是方法學(xué)和實(shí)驗條件的基礎(chǔ)。目前，最基本、最經(jīng)濟(jì)的治療骨質(zhì)疏松癥的方法仍然是鈣營養(yǎng)療法，通過營養(yǎng)控制建立更接近自然狀態(tài)的大鼠骨骼松弛模型。作者試圖在飼料中結(jié)合不同比例的鈣和蛋白質(zhì)，以建立適合大鼠骨骼松弛的動物模型。1材料和方法1.1動物21日齡雌性清潔級Wistar大鼠,體重38～40g,復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗動物部提供(合格證號02-22-4)。1.2i-bgp試驗酪蛋白上海乳品二廠生產(chǎn);碳酸鈣上海泗聯(lián)化工廠生產(chǎn);99mTC-MDP上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠生產(chǎn);125I-BGP試劑盒,解放軍總醫(yī)院長城免疫技術(shù)研究所生產(chǎn),靈敏度<0.22μg/L;125I-E2試劑盒,天津DPC生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn),靈敏度5ng/L。1.3材料、儀器和儀器SPA型單光子大鼠骨密度儀,中國測試技術(shù)研究院裝置,放射源為125I,精密度為2%;DPX-L型雙能X線骨密度儀,美國LUNAR公司生產(chǎn),能譜38/Takev,高壓穩(wěn)定±0.05%,儀器精密度1%。附動物全身骨密度測定軟件;Elscientsp-6型SPECT,附針孔準(zhǔn)直器及低能高分辨率準(zhǔn)直器;PE-3110型原子吸收分光光度計;島津萬能材料測試儀,AG-20N型;HITACH-7110型全自動生化儀。1.4飼養(yǎng)及蛋白質(zhì)40只大鼠按體重隨機(jī)分成5組,第一組為對照組,2～5組為實(shí)驗組,組間體重差別小于1g,不銹鋼籠單籠飼養(yǎng),自由飲水,飼喂不同蛋白質(zhì),鈣含量水平的全價合成飼料見表1。參照AOAC建議方法進(jìn)行飼料配方。1.5生長試驗實(shí)驗第1周至第7周每周稱量體重2次。實(shí)驗第8至20周每周稱重1次,記錄體重增長。1.6巴比妥鈉的應(yīng)用大鼠稱重,以50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉,動物麻醉后置于DPX-L密度儀探頭下,應(yīng)用動物全身骨密度測定軟件作全身掃描,圖象顯示在熒光屏上,并自動打印測定結(jié)果。1.7戊巴比妥鈉tc-mdp實(shí)驗結(jié)束前一周,以玻璃固定器固定大鼠,暴露鼠尾,在離鼠尾根3cm處用酒精棉球擦拭數(shù)遍,并用手術(shù)反光燈(60W)照射尾部。使其尾靜脈充盈,用1ml針筒準(zhǔn)確吸取30MBq的99mTc-MDP靜脈注入。3h后,以50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉。動物麻醉后,俯臥固定在解剖臺上,放在配有低能高分辨準(zhǔn)直器的SPECT探頭下,采集矩陣128×128,采集計數(shù)150K數(shù)據(jù)經(jīng)計算機(jī)自動處理,骨掃描圖像顯示于熒光屏。1.8血清p、me大鼠麻醉后取股動脈血,使用甲基麝香酚蘭測血清Ca,直接測定法測定血清P、血清Mg,對硝基苯磷酸二鈉速率法測定血清AKP含量。125I-BGP試劑盒測血清BGP含量,125I-E2試劑盒測血清E2含量。1.9測定的液體生化值實(shí)驗結(jié)束前,用代謝籠收集大鼠24h尿液。使用EDTA直接滴定法測尿鈣,茚三酮法測尿羥脯氨酸。1.10數(shù)據(jù)分析和方法動物處死后,取右側(cè)股骨去盡肌肉及韌帶組織,稱濕重。用千分卡測量股骨長。然后在2份三氯甲烷和1份甲醇混合液中脫脂72h后,置120℃烘箱烤1h,股骨稱重即為去脂干重。再根據(jù)阿基米德定律測股骨體積。把股骨置坩堝炭化后放入Muffer爐中800℃灰化6h,測得股骨的礦物質(zhì)含量。最后用原子吸收分光光度計測骨鈣。左側(cè)股骨去除附著的肌肉和結(jié)締組織,安置在裝有蒸餾水的有機(jī)玻璃盒支架上,以全長的二分之一交界處為測量點(diǎn),應(yīng)用SPA單光子骨密度儀作骨橫越掃描,測出值即為股骨骨密度。然后用AG-20N島津萬能材料測試儀(跨越10mm,速度為5mm/min),分別測定并記錄最大承受值和骨折時的強(qiáng)度,骨折時的力學(xué)強(qiáng)度即為股骨抗彎力強(qiáng)度。1.11骨組織病理學(xué)檢測處死動物后,取右側(cè)脛骨和第三腰椎,去除附著的肌肉和結(jié)締組織,用10%福爾馬林固定,常規(guī)脫鈣,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察骨組織病理學(xué)改變。1.12數(shù)據(jù)處理和分析全部數(shù)據(jù)均經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理,采用方差分析和t檢驗方法進(jìn)行顯著性檢驗。2結(jié)果2.1周起至第20周實(shí)驗情況低蛋白低鈣和低蛋白中等鈣兩組分別和對照組比,從實(shí)驗第2周起至第20周實(shí)驗結(jié)束,體重差異極顯著(P<0.001)。高蛋白低鈣組與對照組相比僅在實(shí)驗結(jié)束的第20周,即終體重偏小,動物生長發(fā)育狀況優(yōu)于低蛋白低鈣(表2)。2.2密度差異的分析高蛋白低鈣和低蛋白低鈣組動物全身骨密度和股骨骨密度分別與對照組相比,差異極顯著(P<0.001)。低蛋白中等鈣組動物全身骨密度與對照組相比,差異有顯著性(P<0.05)(表3)。2.3總體壓的比較見表1高蛋白低鈣和低蛋白低鈣組動物股骨濕重、長度、體積均小于對照組,差異有顯著性(P<0.05)。高蛋白普通鈣組動物股骨濕重高于對照組,差異極顯著(P<0.001)(表4)。2.4低蛋白普通鈣對大鼠骨鈣量的影響高蛋白低鈣和低蛋白低鈣組動物的抗彎力強(qiáng)度、去脂干重、灰重、骨鈣含量分別與對照組相比,差異極其顯著(P<0.001)。低蛋白普通鈣組動物的抗彎力強(qiáng)度、去脂干重、骨鈣含量與對照組相比,差異均有顯著性(P<0.01)。高蛋白普通鈣組動物的去脂干重、灰重、骨鈣含量均高于對照組,差異有顯著性(P<0.05)(表5)。2.5血清鈣、白低鈣、血清磷、各指標(biāo)血清鈣和血清鎂均以對照組為最高,低鈣組包括高蛋白低鈣和低蛋白低鈣為最低。血清磷以高蛋白普通鈣組為最高,高蛋白低鈣組為最低。血清AKP以高蛋白普通鈣組為最低,低蛋白組包括低蛋白低鈣和低蛋白普通鈣組為最高,但以上比較均無顯著性(表6)。2.6鈣、尿中氨基酸含量詳見表7。2.7對比兩組患者的血清p>0.0.0高(低)蛋白、低鈣兩組動物的BGP含量明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)。高(低)蛋白、低鈣兩組動物的E2水平也較低,與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)(表8)。2.8斯皮爾曼的結(jié)果低蛋白低鈣組的放射計數(shù)明顯高于其余各組,而高蛋白中等鈣組的計數(shù)最少。高蛋白低鈣動物的計數(shù)也較少(表9)。2.9骨小梁表面類生根低蛋白低鈣和高蛋白低鈣組大鼠骨小梁細(xì)小,疏松排列,骨髓腔相對變寬,骨小梁表面類骨質(zhì)增生不明顯(第195頁圖1、2)。對照組動物骨小梁明顯粗大,排列緊密,骨髓腔相對變窄。骨小梁表面類骨質(zhì)增生明顯(第195頁圖3)。3蛋白質(zhì)穩(wěn)定的檢測骨質(zhì)疏松是以骨量減少,骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變和骨折危險頻度增加的疾病。形成骨質(zhì)疏松可有以下四種表現(xiàn)。骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)等比例的減少;由于骨礦物質(zhì)的減少,所以骨骼正常荷載功能發(fā)生變化,在不致發(fā)生骨折的外力作用下也可發(fā)生骨折;在X線照片上,光鏡病理片和電鏡下及骨形態(tài)計量學(xué)方法都可以發(fā)現(xiàn)骨組織的結(jié)構(gòu)和量發(fā)生變化;用各種骨密度測量法、生物化學(xué)檢測法都可為診斷骨質(zhì)疏松癥和鑒別診斷提供重要的參數(shù)。當(dāng)機(jī)體處于鈣邊緣缺乏狀態(tài)時,即當(dāng)我們給予低鈣(0.025%)膳食時,尿鈣和糞鈣減少有利于鈣存留,可抑制骨鈣動員,但機(jī)體對低鈣攝入的適應(yīng)能力有一定限度,當(dāng)長期飼育極低鈣膳食時,機(jī)體也就不得不排除該排出鈣,即為鈣的強(qiáng)制性排出,鈣來源于骨骼,所以骨質(zhì)疏松大鼠組的骨鈣含量低。高蛋白攝入使腎小球鈣濾過率上升尿鈣排出增加。同時高蛋白攝入也使蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物固定酸的含量上升,腎近曲小管鈣重吸收能力下降,也可引起尿鈣升高。高蛋白攝入激發(fā)了胰島素與胰島素樣生長因子(2GF-1)的調(diào)節(jié)作用。研究表明,膳食蛋白質(zhì)加倍,尿鈣增加50%,動物蛋白質(zhì)(如酪蛋白)的高鈣尿效應(yīng)大于植物蛋白質(zhì)(如大豆蛋白)、含硫氨基酸的高鈣尿效應(yīng)大于非含硫氨基酸。人群中蛋白質(zhì)攝入量與股骨上端骨折發(fā)病率顯著相關(guān)。本實(shí)驗中低蛋白低鈣組大鼠雖然骨質(zhì)疏松指標(biāo)與對照組差異極顯著,但這組動物生長極緩慢,成年體重極低,飼料效價低,可能有不可控制的因素導(dǎo)入模型。而高蛋白低鈣組動物生長良好,外觀和對照組大鼠一致,其股骨骨密度,股骨體積,股骨濕重,股骨去脂干重,股骨灰重,股骨抗彎力強(qiáng)度分別與對照組相比,差異均極顯著(P<0.01)。符合骨質(zhì)疏松的特征即骨量(骨灰重、骨鈣含量、骨密度)的明顯減少。股骨的濕重,去脂干重、灰重、骨鈣含量數(shù)據(jù)之間具有高度相關(guān)性,說明本試驗對股骨的處理得當(dāng)。值得一提的是,在本試驗采用的骨質(zhì)元素樣品制備條件(去脂股骨在坩堝電爐上炭化后放入Muffer爐中800℃灰化6h)下,不能用PE-3110型原子吸收分光光度計測出Mn、Mg、Cu、Zn、Fe等微量元素。這可能與灰化溫度過高有關(guān)。高溫致使的樣品揮發(fā)對含量在30%以上的鈣影響不大,但對其他微量元素卻有著較大影響,有文獻(xiàn)報道,溫度應(yīng)控制在450℃,24h灰化。高蛋白低鈣組骨質(zhì)疏松模型動物血清鈣、血清磷、血清鎂和血清堿性磷酸酶含量,其變化雖有規(guī)律但與對照組比較差異均無顯著性,這可能與機(jī)體會通過一系列適應(yīng)性反應(yīng)來維持骨量有關(guān),如低鈣攝入使血PTH升高,然后腎細(xì)胞中磷含量增高,腎1α-羥化酶活性上升,腎近曲小管1,25(OH)2D3合成加快,小腸上段鈣主動吸收加快,糞鈣減少,最終使血鈣又回升。本次研究結(jié)果提示:骨質(zhì)疏松模型動物BGP水平明顯低于對照組,說明高蛋白低鈣組大鼠骨轉(zhuǎn)換或骨形成能力低下。尤其值得注意的是,當(dāng)BGP低于正常時,其血清鈣、磷、鎂和AKP值與對照組無差異(P>0.05)。由此可見,血清BGP與BMD一樣對骨形成和骨轉(zhuǎn)換變化的反映較血鈣,血磷、血鎂,血AKP反映更為敏感可靠。雌二醇對骨的主要作用是抑制骨吸收。本實(shí)驗中骨質(zhì)疏松模型動物的E2值偏低,使骨吸收加快。高蛋白低鈣骨質(zhì)疏松模型動物尿鈣,尿羥脯氨酸的含量均高于對照組(P<0.001)。高蛋白和極低鈣膳食均促使大鼠鈣的強(qiáng)制性排出。當(dāng)大鼠處于骨轉(zhuǎn)換的負(fù)平衡時,還可引起骨的膠原蛋白代謝異常,促進(jìn)尿HOP的排泄增加,從而導(dǎo)致骨韌性降低,脆性增加。結(jié)果提示:尿鈣及尿羥脯氨酸的測定須收集24小時尿,能夠比較準(zhǔn)確反應(yīng)機(jī)體鈣HOP的排出水平?？蓱?yīng)用空腹晨尿測尿Ca和尿肌肝比值(Ca/Cr)。雖然報道人體采用此法,靈敏準(zhǔn)確,不受尿量硬響。但對于大鼠卻存在尿量少,無法排除夜間尿和晨濃縮尿。所以,大鼠尿樣的采集正確與否,直接影響著尿液生化結(jié)果的準(zhǔn)確性。高蛋白低鈣骨質(zhì)疏松模型大鼠全身骨密度測定和SPECT全身骨顯像,均在動物活體進(jìn)行,和人體的防病、治病,藥物療效等方面應(yīng)用,有良好的對比性。SPECT的圖像觀察比較直觀,并在活體上反映了骨代謝狀況。高蛋白低鈣骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織病理發(fā)現(xiàn)大鼠骨小梁細(xì)小,疏松排列,骨髓腔相對變寬,骨小梁表面類骨質(zhì)增生不明顯。有文獻(xiàn)報道幼鼠缺鈣所致病變可是骨質(zhì)疏松癥,或是佝僂病。青春期鈣攝入不足對峰狀骨質(zhì)會產(chǎn)生不可逆的有害影響。在幼鼠,影響骨量的最主要的