基于物種多樣性的厭氧反應器內(nèi)顆粒污泥微生物種群結構研究

基于物種多樣性的厭氧反應器內(nèi)顆粒污泥微生物種群結構研究

產(chǎn)甲烷污泥是高效厭氧反應體系穩(wěn)定運行的基礎和關鍵。現(xiàn)在，許多科學家已經(jīng)研究了它們的形成機制、微觀結構和微生物群。然而，在之前的研究中，很難使用電鏡觀察、培養(yǎng)基培養(yǎng)和計數(shù)等傳統(tǒng)方法。這些方法可以由于自身的固有局限性而難以精確、深入地研究。生物技術可以克服傳統(tǒng)方法的缺點，近年來廣泛應用于微生物群的研究。一些中國科學家還將這些技術用于研究好氧和厭氧微生物群的微生物群，并取得了一些成果。產(chǎn)甲烷污泥結構特殊，其中古細菌與真菌并存。用分子生物技術全面研究微生物群的報道相對較少。在本實驗中，以厭氧產(chǎn)甲烷反應不同運營階段的污泥為研究對象，使用原熒光原雜交技術（昆蟲）研究樣品中真菌和真菌的相對數(shù)量和空間分布，并比較不同樣品中真菌和假菌的結構差異。通過對舊細菌dgge譜中條段的膠回收、系統(tǒng)發(fā)育分析，以及根據(jù)器官技術條件對研究結果進行了討論和分析。1材料和方法1.1產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品的取得試驗中產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品取自本實驗室內(nèi)的一個小試厭氧反應器,反應器為有機玻璃制成,總體積15L.接種污泥為處理實際淀粉廢水的EGSB內(nèi)的顆粒污泥.試驗進水為葡萄糖自配水,按COD∶N∶P約為400∶2.5～5∶1的比例投加尿素和磷酸二氫鉀,反應器內(nèi)pH值控制在6.8～7.2之間,溫度在35℃左右.在反應器啟動與穩(wěn)定運行的過程中,每隔一定時間從反應器底部取出泥樣,共取得4個產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品,其中樣品A:啟動后第1d取得,即接種污泥;樣品B:運行25d后取得,反應器的COD負荷約為20kg/(m3·d);樣品C:運行75d后取得,反應器COD負荷為35kg/(m3·d);樣品D:反應器停止運行1個月后,重新啟動運行45d后取得,COD負荷重新恢復至35kg/(m3·d).1.2細菌保鮮和成像采集污泥樣品后,立即用4%多聚甲醛溶液固定,待PBS緩沖液洗滌后,于PBS緩沖液和100%乙醇兩者的等體積混合液中在-20℃下保存,再利用石蠟包埋切片技術進行處理.采用CY3(紅色)標記的EUB338探針和FITC(綠色)標記的ARC915探針,其序列見表1.對上述預處理后的顆粒污泥樣品進行雙重原位雜交,雜交溫度為46℃,雜交甲酰胺濃度分別為25%和35%.同時利用DAPI(4P,6-diamidin-2-phenylindole)染色作為泥樣中所有微生物的背景,在Olympus激光共聚焦顯微鏡上掃描成像觀察.1.3總dna提取采用滾珠振蕩機械破碎法提取,將顆粒污泥放入磨砂滾珠離心管中,加CTAB充分振蕩,再用fastprep振蕩破碎儀(Bio-Rad公司)振蕩1min;樣品破碎后,采用溶菌酶蛋白酶K水解,Tris-飽和酚抽提與異丙醇沉淀分離提取DNA;最后采用DNA純化試劑盒A014(鼎國公司)進行純化.1.4pcr擴增dcke使用PTC-200擴增儀(MJ公司)進行PCR擴增,擴增對象為16S-rDNA的V2-V3可變區(qū).對于真細菌,引物為PRBA8F與PRUN518R;對于古細菌,引物為PARC109F與PRUN518R;其序列見表2,為提高DGGE分辨效率,在PRUN518R的5′端加GC卡.PCR反應體系中各物質最終濃度如下:10×PCR緩沖液10%,MgCl2溶液1.5mmol/L,dNTP200μmol/L,引物各0.5μmol/L,模板5ng/μL,TaqDNA聚合酶0.025μ/μL.對于真細菌,按照94℃變性1min,60℃退火30s,72℃延伸1min循環(huán)25次;對于古細菌,除退火溫度為55℃外,其它條件均與上述相同.1.5微生物種群相似度在Dcode系統(tǒng)(Bio-Rad公司)上進行DGGE分析,聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%,真細菌和古細菌的變性劑濃度范圍分別是35%～50%和30%～50%,在1×TAE緩沖液中,以120V電壓,60℃恒溫電泳5～6h.電泳后,以1×SYBRGold(Invitrogen公司)染色,用GSD8000成像系統(tǒng)(UVP公司)進行結果觀察和照相.以Phoretix1D軟件(Nonlinar公司)對DGGE圖譜進行分析,考察樣品之間的微生物種群的相似性,并繪制相似性分析圖.1.6序和系統(tǒng)發(fā)育分析2結果與討論2.1產(chǎn)甲烷顆粒污泥的主要細菌分布對前3個污泥樣品進行FISH實驗,結果如圖1.在樣品A、B、C中真細菌含量均明顯高于古細菌;真細菌主要分布在顆粒污泥外層,古細菌主要分布在內(nèi)層,而顆粒中心則基本未表現(xiàn)出生物活性;且隨著反應器COD負荷的增加以及運行時間的延長,古細菌的數(shù)量相應略有增加,其分布更趨向于顆粒污泥的中心區(qū)域.在產(chǎn)甲烷顆粒污泥中,水解菌、發(fā)酵產(chǎn)酸菌以及產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌等真細菌并不是十分嚴格的厭氧細菌,且通常這些真細菌直接吸收和利用原廢水中的有機基質,所以這些細菌通常會生長分布在顆粒污泥的外層;而顆粒污泥中主要的古細菌是其中的產(chǎn)甲烷細菌,它們是嚴格的厭氧細菌,且利用真細菌的代謝產(chǎn)物,因此,在3個樣品中,古細菌均分布在顆粒污泥的內(nèi)層;同時,厭氧反應器的啟動過程實際上主要就是產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)過程,隨著COD負荷的逐漸提高以及運行時間的延長,古細菌的相對數(shù)量逐漸增多.2.2充填泥中真細菌種群相似性對4個顆粒污泥樣品同時進行總DNA提取、純化,經(jīng)過PCR擴增后再進行DGGE分析,最終得到其中真細菌的DGGE圖譜,如圖2所示,利用Phoretix1D軟件對真細菌的DGGE圖譜進行相似性分析,如圖3所示.一般認為,在DGGE圖譜上,每一條帶代表某種特定的微生物,且亮度相對大的條帶代表樣品中的優(yōu)勢微生物.因此,圖2表明,與接種污泥A相比,在小試反應器中運行不同時間后的樣品B、C和D中真細菌的種類和優(yōu)勢菌種均發(fā)生了一定的變化;且樣品B與C的真細菌種群結構基本相似;而樣品D與B、C相比又有一定的差異.圖3也表明類似的結果,樣品A與B、C和D的真細菌種群相似性均較低;樣品B與C的真細菌種群相似性高達83%;而樣品D與B、C的真細菌種群相似性又有所降低.與古細菌相比,真細菌生長迅速,易于死亡.接種污泥在接種之前已在常溫、半封閉狀態(tài)下放置了2個月左右,待反應器運行后,真細菌的活性逐漸恢復,故接種污泥與小試反應器運行后的樣品之間,真細菌種群相似性較低;隨著反應器穩(wěn)定的運行,顆粒污泥中真細菌的種群結構沒有因為COD負荷的增加以及運行時間的延長發(fā)生顯著的變化;但反應器停止運行1個月后重新啟動,真細菌經(jīng)歷了一個死亡后再生長的過程,真細菌種群結構再次發(fā)生一定的變化.2.3接種污泥中的古細菌種對4個顆粒污泥樣品同時進行總DNA提取、純化,經(jīng)過PCR擴增后再進行DGGE分析,最終得到其中古細菌的DGGE圖譜,如圖4所示,利用Phoretix1D軟件對古細菌的DGGE圖譜進行相似性分析,如圖5所示.圖4表明,隨著反應器COD負荷的增加以及運行時間的延長,顆粒污泥中古細菌種群結構發(fā)生較明顯的變化,接種泥樣A中各菌種數(shù)量上相對均勻,而反應器運行不同時間后的樣品B、C和D中占優(yōu)勢的古細菌種類逐漸減少;且古細菌種群結構的變化速率由快到慢,樣品A與其他3個樣品中古細菌的種類和優(yōu)勢菌種有很大差異,而樣品C與D中古細菌的種群結構差異較小.圖5也表明類似的結果,樣品之間的相似性分別為58%、66%和71%,呈逐漸增加趨勢.古細菌生長易于受到環(huán)境因素的影響,進水成分和COD負荷的差異會導致古細菌種群結構發(fā)生較明顯變化.接種污泥是處理實際淀粉廢水的厭氧顆粒污泥,進水成分復雜,經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酸過程后,生成的甲烷前體物種類也較復雜,因此,其古細菌種類較多.而小試厭氧反應器的進水為葡萄糖自配水,甲烷前體物種類較單一,使運行后期的樣品中優(yōu)勢菌種的種類明顯減少;且接種污泥對應的COD負荷較低,隨著COD負荷的逐漸增加,古細菌種群結構不斷地發(fā)生變化,COD負荷相同的樣品C與D中古細菌的相似性也較高.即與真細菌相比,古細菌種群結構更易受到進水成分和COD負荷改變的影響,這與其他學者的研究結果相符.2.4甲烷桿菌屬中的發(fā)育樹將古細菌DGGE圖譜中有代表性的7個條帶自上至下編號,如圖4所示.對7個條帶切膠回收并測序,其序列輸入Genbank數(shù)據(jù)庫進行比對,并提交序列(AccessionNo.:DQ272259～DQ272265),進而繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖6.可知,其中3個序列3、4和6與甲烷桿菌屬中的模式菌種(Methanobacteriumformicicum)相似性達98%以上;序列5與甲烷微粒菌屬中的模式菌種(Methanocorpusculumparvum)相似性達99%;序列7與甲烷髦毛菌屬中的菌種(Methanosaetaharundinacea)相似性達99%;序列1與可培養(yǎng)微生物相似性低,與其他學者在厭氧反應器及自然厭氧環(huán)境中獲得的克隆序列(unculturedarchaeon)相似性達98%以上;而序列2與Genbank數(shù)據(jù)庫中已有序列相似性均低于95%,很可能是1種未知古細菌.因此,本研究中的小試厭氧產(chǎn)甲烷反應器內(nèi),最適合生長的古細菌主要包括甲烷微粒菌、甲烷桿菌和甲烷髦毛菌等.3菌株組成中的細菌(1)顆粒污泥中真細菌的含量明顯高于古細菌;真細菌主要分布在顆粒污泥外層,古細菌主要分布在內(nèi)層,而顆粒中心則基本未表現(xiàn)出生物活性;且隨著反應器COD負荷的增加以及運行時間的延長,古細菌的數(shù)量相應略有增加,其分布更趨向于顆粒污泥的中心區(qū)域.(2)隨著反應器COD負荷的增加以及運行時間的延長,真細菌種群結構相對較穩(wěn)定,而