大鼠下丘腦室旁核gababr1陽(yáng)性神經(jīng)元對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)

大鼠下丘腦室旁核gababr1陽(yáng)性神經(jīng)元對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)

0gaba及其受體對(duì)免疫應(yīng)激反應(yīng)的影響脂肪醇（eps）可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，刺激身體的免疫反應(yīng)。動(dòng)物注射ls是研究免疫、體液關(guān)系的一般模型。gaba是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個(gè)重要的緩沖器，通過(guò)脫離性皮膚感染物質(zhì)。gababr1和gababr2是受體的主要部分。gababr1是受體的主要部分，gababr1是受體的主要部分，腦病是人體和獨(dú)立神經(jīng)系統(tǒng)的綜合中心，室旁核（pvn）是大腦中的一個(gè)重要核。它通過(guò)大腦、仙女和腎臟軸支配各種應(yīng)反應(yīng)。以往的研究表明，gababr1是gababn的大腦。另一方面，lps刺激可以導(dǎo)致pvn神經(jīng)元素的fos，這表明pvn元素的參與會(huì)受到cps刺激的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但如果ps在激活的apn中激活，則沒(méi)有直接證據(jù)表明gaba及其受體對(duì)大腦的免疫反應(yīng)的影響。1材料和方法1.1fos、北鼠、gababr1和豬克薩斯紅健康成年SD雄性大鼠12只,體質(zhì)量200~250g,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.兔抗Fos抗體(Sigma公司);豚鼠抗GABABR1抗體,得克薩斯紅結(jié)合的羊抗兔IgG,異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的驢抗豚鼠IgG(Chemicon公司);Leica1800恒冷箱切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司);FV1000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司).1.2方法1.2.1鹽水溶解的lps動(dòng)物購(gòu)入后置于安靜、溫暖(25℃左右)、避強(qiáng)光和自由攝食的環(huán)境中飼養(yǎng)48h,避免非特異性應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生.將動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(6只)和對(duì)照組(6只).于8∶00點(diǎn)在大鼠清醒狀態(tài)下,對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠迅速腹腔注射300μL生理鹽水溶解的LPS,250g/kg;對(duì)照組注射等劑量的生理鹽水.兩組動(dòng)物在上述相同環(huán)境中放置3h后,用過(guò)量10g/L戊巴比妥鈉(>40mg/kg)深度麻醉,迅速開(kāi)胸經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管,先以100mL生理鹽水洗去血液,繼用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/LPBS(pH7.4,4℃)先快后慢灌流固定,取出全腦置于相同的灌注液中后固定4~6h,然后將材料移至含300g/L蔗糖的PB內(nèi),4℃保存直至組織沉底.恒冷箱切片機(jī)切制含PVN的間腦連續(xù)冠狀切片,片厚30m,切片共分5套,分別用于Fos,GABABR1單標(biāo)記和雙標(biāo)記以及對(duì)照,另一套做備用.切片收集于盛有0.01mol/LPBS的網(wǎng)格內(nèi),PBS洗3次×10min,待用.1.2.2克薩斯紅、羊抗兔以及聯(lián)合豬抗羊鼠igg的表達(dá)將兔抗Fos抗體(1∶500)和豚鼠抗GABABR1抗體(1∶1000)用含10g/L小牛血清白蛋白和1g/LTritonX-100的0.01mol/LPBS混合后常溫孵育切片24h,用0.01mol/LPBS洗3次×10min,然后用得克薩斯紅交聯(lián)的羊抗兔IgG(1∶500)和FITC交聯(lián)的驢抗豚鼠IgG(1∶500)混合液常溫孵育切片2h,用0.01mol/LPBS洗3次×10min,將組織切片貼于載玻片上,自然涼干,用含500g/L甘油的0.01mol/LPBS封片.單標(biāo)記過(guò)程同上,抗體用相應(yīng)的組套.在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像.1.2.3大鼠fos和gababr1免疫陽(yáng)性神經(jīng)元檢測(cè)除一抗用正常的血清白蛋白代替外,其他程序與上述過(guò)程相同,正常血清孵育的組織片上檢測(cè)不到Fos和GABABR1免疫陽(yáng)性神經(jīng)元.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每只大鼠在含PVN前、中、后平面上各選取3張切片,計(jì)數(shù)單標(biāo)記和雙標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量,取每組6只的平均值.結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,用SPSS13.0對(duì)組間差別進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)意義.2結(jié)果2.1兩組細(xì)胞形態(tài)和gababr1表達(dá)情況GABABR1陽(yáng)性產(chǎn)物見(jiàn)于神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)內(nèi),標(biāo)記的神經(jīng)元發(fā)出明亮的綠色熒光,細(xì)胞輪廓清楚,胞核未染,細(xì)胞形態(tài)多呈圓形,突起不明顯(圖1A,B).陽(yáng)性神經(jīng)元較多地分布在下丘腦PVN外側(cè)大細(xì)胞部,并向內(nèi)延續(xù)到小細(xì)胞部及腹側(cè)部,但數(shù)量逐漸減少、染色強(qiáng)度逐漸減弱.雖然LPS組的GABABR1陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)較對(duì)照組稍多、有些神經(jīng)元染色較重,但兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2).2.2兩組大鼠fos表達(dá)情況Fos陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)出明亮的紅色熒光,陽(yáng)性產(chǎn)物限于胞核內(nèi),胞核深染、圓形,邊緣光滑,胞質(zhì)未染色,因而樹(shù)突、胞體未顯示.對(duì)照組大鼠Fos僅有零星散在分布(圖1C).LPS組Fos陽(yáng)性神經(jīng)元主要見(jiàn)于下丘腦PVN內(nèi)側(cè)小細(xì)胞部和腹側(cè)部,在外側(cè)大細(xì)胞部也有少量分布(圖1D);LPS實(shí)驗(yàn)組的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多,常是對(duì)照組的數(shù)倍,兩組比較差異顯著(P<0.01,圖2).2.3babr1雙標(biāo)記神經(jīng)元在Fos和GABABR1雙標(biāo)記的切片中可以看到3種類型的標(biāo)記細(xì)胞:發(fā)出明亮紅色熒光的Fos神經(jīng)元、發(fā)出明亮綠色熒光的GABABR1神經(jīng)元和Fos/GABABR1雙標(biāo)記神經(jīng)元.雙標(biāo)的特點(diǎn)為在同一神經(jīng)元內(nèi),胞質(zhì)為GABABR1陽(yáng)性發(fā)出的綠色熒光,胞核為Fos陽(yáng)性發(fā)出明亮的紅色熒光(圖1E~G).在LPS組,Fos/GABABR1雙標(biāo)神經(jīng)元主要分布于下丘腦PVN的外側(cè)大細(xì)胞部與小細(xì)胞部交界處以及PVN腹側(cè)部.Fos/GABABR1雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)量分別約占Fos和GABABR1單標(biāo)細(xì)胞數(shù)量的30%和24%.對(duì)照組少見(jiàn)雙標(biāo)細(xì)胞,無(wú)分布規(guī)律(圖1E).兩組大鼠下丘腦室旁核各種類型標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖2.3pvn神經(jīng)元/gababr1神經(jīng)元/gababr1神經(jīng)元/gababr1神經(jīng)元/gaba-h在LPS刺激引起的應(yīng)激反應(yīng)中,神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)三者之間相互作用、相互影響,最終達(dá)到恢復(fù)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.在此反應(yīng)過(guò)程中,下丘腦-垂體-腎上腺軸起關(guān)鍵作用.以往的研究指出,全身或中樞急性注射LPS可以增加下丘腦PVN內(nèi)腎上腺素釋放激素(CRF)mRNA及CRF的水平,而損毀下丘腦后則不會(huì)發(fā)生此種情況,因此認(rèn)為L(zhǎng)PS可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸,并認(rèn)為激活的起始點(diǎn)在PVN.在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)腹腔注射LPS后,PVN內(nèi)有大量的表達(dá)Fos的神經(jīng)元,陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布在內(nèi)側(cè)小細(xì)胞部和腹側(cè)部,進(jìn)一步證實(shí)LPS對(duì)下丘腦的激活作用.這個(gè)結(jié)果與以往的研究結(jié)果基本一致.LPS對(duì)下丘腦神經(jīng)元激活的途徑目前還不完全清楚,可能是通過(guò)刺激巨嗜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,如TNF-α,IL-1,IL-6等對(duì)PVN神經(jīng)元直接作用,或者是通過(guò)外周內(nèi)臟感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)到延髓內(nèi)臟帶,再傳導(dǎo)至PVN而發(fā)揮作用.形態(tài)學(xué)研究表明PVN內(nèi)有大量的GABA神經(jīng)終末,這些GABA能纖維可能來(lái)源于下丘腦局部或終紋床核等.近來(lái)的研究還指出PVN內(nèi)既有GABAAR,也有GABABR.生理學(xué)和形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)還顯示兩類受體都存在于PVN的CRF神經(jīng)元或分泌加壓素(VP)神經(jīng)元上.而此兩種神經(jīng)元在下丘腦-垂體-腎上腺軸對(duì)LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)中又起重要作用.但以往沒(méi)有直接證據(jù)說(shuō)明PVN內(nèi)表達(dá)兩種受體的神經(jīng)元直接參與了LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)中,我們給動(dòng)物腹腔注射LPS,在下丘腦PVN內(nèi)觀察到許多既是Fos陽(yáng)性、又表達(dá)GABABR1的神經(jīng)元,首次證明了GABABR1參與了由LPS的誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng).我們最近的實(shí)驗(yàn)也證明了GABAAR1也參與了這個(gè)反應(yīng).GABA受體陽(yáng)性神經(jīng)元參與免疫應(yīng)激反應(yīng)的意義可能在于,這些神經(jīng)元通過(guò)接受機(jī)體的應(yīng)激信息而激活,從而抑制丘腦-垂體-腎上腺軸的過(guò)度興奮,減輕機(jī)體對(duì)LPS刺激的過(guò)強(qiáng)反應(yīng),維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,起到了機(jī)體保護(hù)作用.其中GABABR1屬于代謝性受體,可能較GABAAR在此過(guò)程中發(fā)揮更加持久的作用.雖然GABABR1陽(yáng)性神經(jīng)元與Fos陽(yáng)