生物材料表面的生物相容性

生物材料表面的生物相容性

1表面修飾技術(shù)血管移植的生物材料在移植后不可避免地與人體組織或血液接觸，導(dǎo)致血液抑制，從而影響材料的愈合效果。因此，這種材料的表面性質(zhì)對改善生物適應(yīng)性非常重要。表面修飾是生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的核心技術(shù)之一,其根本目的就是要使生物材料表面具有更好的生物相容性。與表面反應(yīng)相關(guān)的參量有很多,如親水/疏水性、表面能、表面勢、官能團(tuán)、表面電荷、受體位點(diǎn)、分子的運(yùn)動、粗糙度/質(zhì)地以及表面分子的空間取向等。表面修飾就是通過改變這些性質(zhì)來控制生物材料表面的生物反應(yīng)性質(zhì)。目前,表面修飾技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于心血管植入生物材料的表面改性以提高其生物相容性。除了設(shè)計、制備性能優(yōu)異的新材料外,通過對傳統(tǒng)材料進(jìn)行表面物理、化學(xué)和生物改性是一條有效的途徑。表面覆膜是應(yīng)用比較早的一種方法,通過不同的方法在材料表面制備一層無機(jī)的或者有機(jī)的薄膜,可以起到提高材料血液相容性和抗腐蝕性的作用,如類金鋼石薄膜、纖維涂層、碳化硅涂層、Ti-O薄膜等。但是,以上方法仍然擺脫不了遠(yuǎn)期血栓的形成和并發(fā)癥的出現(xiàn)。另外,人們還采用了包括表面化學(xué)接枝、光接枝、等離子體接枝等技術(shù)對生物材料的宏觀表面性質(zhì)進(jìn)行了修飾,也在不同程度上改良了材料的生物相容性。但是,隨著人們對生物材料———表面界面的非特異性作用和生命單元表面行為的不斷認(rèn)識,越來越多的研究者認(rèn)識到,只有在更微觀的尺度上實(shí)現(xiàn)對生物材料的表面特異性生物活性作用的精確控制才是從根本上解決生物材料生物相容性的關(guān)鍵。目前,表面接枝生物分子以改善生物相容性的生物方法即是著眼于此。表面接枝生物分子是近些年來發(fā)展比較快的一種生物材料表面修飾方法,這種方法首先在物理力學(xué)性能適合的材料表面引入官能團(tuán),然后通過各種方式引發(fā)聚合,建立特定的分子結(jié)構(gòu),把具有抗凝血或者促內(nèi)皮化功能的分子接枝到材料表面,以賦予材料優(yōu)良的血液相容性和細(xì)胞相容性。而且所選用的生物分子本身毒性較低,具有較好的生物相容性,通過選擇不同的生物分子,如肝素、RGD肽段、VEGF等,可以獲得具有抗凝或促內(nèi)皮化等不同生物學(xué)功能的表面,而且還具有表面構(gòu)建的可控性。2微圖形技術(shù)的應(yīng)用目前,心血管植入生物材料表面固定生物分子的方法主要分為物理方法和化學(xué)方法兩種。物理方法主要包括物理吸附法、靜電自組裝法、以及微接觸印刷術(shù),其中物理吸附法最簡單,但其固定的生物分子在體內(nèi)的釋放難以控制,無法保證其長期療效,目前采用直接物理吸附的方法固定生物分子的研究已經(jīng)比較少見。靜電自組裝法制備工藝簡單,通過簡單的交替浸涂技術(shù)可實(shí)現(xiàn)材料表面組裝分子納米、亞微米尺度的有規(guī)結(jié)構(gòu)設(shè)計,能保證生物分子的生物活性,并可在具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的裝置和材料上實(shí)現(xiàn)。因此,該技術(shù)在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的研究中得到廣泛的應(yīng)用。微圖形技術(shù)是一種可控的表面圖案化微制作技術(shù),適用于微米、納米級圖形的制作,實(shí)現(xiàn)小分子、聚合物、生物大分子,以及細(xì)胞在材料表面的選擇性吸附或粘附。如Zhang等采用微圖形模塑技術(shù)在鈦(Ti)基生物材料表面制備了PEG-Hep/Fn復(fù)合條帶狀圖形,實(shí)現(xiàn)圖形對血小板粘附和激活的調(diào)控行為,有助于進(jìn)一步了解心血管生物材料表面與血小板的相互作用機(jī)制。化學(xué)方法中最常用的是共價固定法,主要借助生物大分子上的官能團(tuán)跟基材表面的功能基團(tuán)通過化學(xué)鍵合使分子固定于材料表面,提高了固定生物分子的穩(wěn)定性。但大多數(shù)無機(jī)材料表面除含有少量羥基外,缺乏并且不易引入足夠的功能基團(tuán)來連接活性分子?，F(xiàn)多使用化學(xué)/電化學(xué)處理,自組裝單分子層(self-assemblymonolayer,SAM)和表面等離子體處理等方法來增加已有活性基團(tuán)(羥基)數(shù)量或引入其它活性基團(tuán)(氨基、羧基等)。而對于高分子材料來說,因其表面存在一些反應(yīng)官能團(tuán),共價固定生物分子要相對容易一些。共價固定提高了生物分子的穩(wěn)定性,但可能會造成生物活性的損失,但是根據(jù)基底材料的不同和所選擇生物分子的差異,可以實(shí)現(xiàn)保持較高的生物分子的活性。Kishida等在PAA-g-PE表面共價固定了血栓調(diào)節(jié)蛋白,結(jié)果證實(shí)血栓調(diào)節(jié)蛋白可以保持較好的抗凝活性。此外,還有配位結(jié)合固定生物分子的方法,如多巴胺中的酚羥基被氧化后,能夠通過配位鍵與金屬氧化物(如TiO2等)穩(wěn)定結(jié)合,同時,多巴胺發(fā)生自聚合,從而在金屬氧化物表面形成結(jié)合牢固的聚多巴胺層,聚多巴胺層具有豐富的反應(yīng)活性基團(tuán),為生物活性分子的固定提供了條件。目前,眾多研究者已開始結(jié)合兩種或者幾種方法來固定生物分子,在提高生物分子穩(wěn)定性的同時保證所固定生物分子的活性,這也將是今后關(guān)注的重點(diǎn)。3根據(jù)不同應(yīng)用目的的心血管生物材料表面活性劑3.1復(fù)合生物分子的作用目前固定生物分子提高植入物血液相容性主要包括固定單一生物分子和復(fù)合生物分子(兩種或多種生物分子)兩個方面。單純采用物理吸附或者靜電作用固定單一生物分子的研究較少,因?yàn)椴捎眠@兩種方法固定的生物分子的穩(wěn)定性較差。共價固定的生物分子則具有較高的穩(wěn)定性,但固定生物分子前通常會預(yù)先賦予基底表面一定的反應(yīng)性功能基團(tuán)。與提高血液相容性相關(guān)的生物分子有很多,包括多糖類的肝素、硫化肝素、殼聚糖和與抗凝相關(guān)的酶等。肝素具有較好的抗凝性能,是目前臨床上常用的抗凝藥物,肝素化生物材料被認(rèn)為是改善血液相容性最傳統(tǒng)的方法,但將肝素直接用共價鍵接枝到材料表面會降低肝素的抗凝血性,因?yàn)椴牧吓c肝素之間的共價鍵合抑制了肝素的活性。為保持肝素的活性,可以用一親水性的“空間臂”如聚氧化乙烯連接材料表面和肝素,從而既提高肝素的穩(wěn)定性又保持其抗凝活性。藻酸鈉是多糖家族的一員,Yoshioka等利用氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)將藻酸鈉固定在不銹鋼表面,發(fā)現(xiàn)具有抑制血小板粘附的效果,在改善無機(jī)心血管生物材料血液相容性方面具有潛在應(yīng)用價值。Kishida等將人重組血栓調(diào)節(jié)蛋白共價固定到PEUU表面,發(fā)現(xiàn)經(jīng)血栓調(diào)節(jié)蛋白修飾的材料具有更好的抑制血小板粘附和聚集的能力,大大提高了血液相容性。Baker將具有抗凝血性能的磷酸酶(Apyrase),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)這種酶修飾過的表面的血液相容性得到了顯著改善。針對以上現(xiàn)象,Nilsson等對Apyrase的抗凝血機(jī)制進(jìn)行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)Apyrase主要是通過破壞可以導(dǎo)致血小板激活的ADP通路來抑制血小板的激活達(dá)到較好的血液相容性。另外,在材料表面形成膠原和明膠涂層后,材料的抗凝血能力也得到了提高。復(fù)合生物分子的固定主要包括層層自組裝(layerbylayer,LBL)技術(shù)和先后/共混生物分子固定技術(shù)。如采用聚陽離子聚乙烯基亞胺(PEI)和白蛋白的層層自組裝,可在多種材料上形成穩(wěn)定的白蛋白層,從而形成生物惰性表面。通過LBL技術(shù)還可用于構(gòu)建抗細(xì)胞粘附的表面,如海藻酸鈉/聚賴氨酸多層膜,可以顯著降低材料表面粘附的細(xì)胞數(shù),可應(yīng)用于外科手術(shù)后的愈合和防粘連,以及心血管植入材料表面以防止血細(xì)胞的粘附。Tan等利用PEI和肝素層層沉積的方法制備了具有抗凝血功能的表面,發(fā)現(xiàn)這種表面能夠抵抗血小板的粘附并有效延長靜態(tài)凝固時間,從而為心臟血管裝置的表面改性提供了新的方法。另外,聚電解質(zhì)的種類、組裝條件等會影響LBL膜的生物活性,如Houska等制備肝素和白蛋白LBL多層膜,當(dāng)肝素為最外層時,可顯著增加抗凝血因子Ⅲ的粘附;而當(dāng)白蛋白為最外層時,可有效降低血纖維蛋白原、球蛋白和血小板的粘附。Serizawa研究了在不同鹽濃度條件下采用LBL法構(gòu)建磺化葡聚糖/殼聚糖表面,研究表明膜的厚度隨鹽濃度升高而增加。只有在鹽濃度高于某一臨界值時才可能獲得凝血/抗凝血交替變化的表面。肝素/殼聚糖的LBL多層膜的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有較好的血液相容性。另外,Chen等在Ti表面構(gòu)建了膠原/肝素多層膜,發(fā)現(xiàn)材料的血液相容性也得到了較大的改善。目前,LBL法負(fù)載生物活性物質(zhì)改善生物相容性的研究引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。先后/共混生物分子的固定主要利用了兩種分子之間的共價結(jié)合作用或者分子間的特異性識別,然后跟具有反應(yīng)性官能團(tuán)的表面結(jié)合。采用先后順序?qū)⒅辽賰煞N生物分子固定在生物材料表面的研究比較多見,Wang等采用EDC交聯(lián)的方法首先將具有—NH2反應(yīng)官能團(tuán)的殼聚糖固定在PLGA表面,然后再將具有—COOH官能團(tuán)的肝素分子共價固定在殼聚糖上,形成肝素/殼聚糖復(fù)合膜,結(jié)果顯示這種復(fù)合膜具有較好的血液相容性。Zhu等利用光化學(xué)接枝的方法先將疊氮酸鹽標(biāo)記的殼聚糖固定在PLA表面,隨后將肝素成功固定在殼聚糖上,也形成了肝素/殼聚糖復(fù)合膜,同樣具有較好的抑制血小板粘附和激活的性能。目前,采用共混的方法將兩種或者多種生物分子固定在材料表面的研究還相對較少,胡珂等將預(yù)先形成的多聚賴氨酸-肝素的納米顆粒固定多巴胺涂覆的純鈦表面,發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物可以極大地改善材料的血液相容性。Chen等將尿激酶和血栓調(diào)節(jié)蛋白同時共價固定到磷酸化的PEG表面后,發(fā)現(xiàn)修飾后的材料的血液相容性較好,而且這兩種生物分子的釋放均比較緩慢且活性都能保持得比較好,這有助于改善病人的血栓形成并發(fā)癥和提高病人的存活率。另外,還有研究者采用靜電復(fù)合的方法在特定pH值下首先使帶負(fù)電的肝素和帶正電的纖連蛋白分子共混形成復(fù)合物,然后再固定到材料表面,以改善材料的抗凝血和促內(nèi)皮化性能,為心血管植入材料的設(shè)計和研發(fā)提供理論參考。3.2生物材料的復(fù)合方式對表面的修飾作用改善抗凝血乃至血液相容性最理想的途徑是在生物材料的表面形成內(nèi)皮化。但是,直接把內(nèi)皮細(xì)胞種植在材料表面不僅繁殖慢而且還容易從材料表面脫落下來。為了促進(jìn)材料表面的內(nèi)皮化,可以在表面固定能促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖的蛋白,如膠原蛋白、層粘連蛋白或多肽(如RGD)。蛋白質(zhì)和多肽往往具有特定的生物信號,可以顯著地改善細(xì)胞在材料表面的粘附,但是,蛋白質(zhì)存在一定的免疫反應(yīng)和潛在的未知病毒的風(fēng)險,因此限制了其大規(guī)模應(yīng)用。而多肽卻能克服以上缺點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)對特定細(xì)胞的選擇性粘附。最近10年間,人們一直利用仿生工程技術(shù)致力于少數(shù)肽鏈與生物表面連接的研究。RGD肽是最常見的多肽,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外蛋白質(zhì)的連接,含有RGD的肽段固定到生物材料表面上具有較好改善內(nèi)皮細(xì)胞相容性的作用。但研究中發(fā)現(xiàn)單一生物分子固定并不能達(dá)到非常理想的促內(nèi)皮化效果,而在生物體中各種復(fù)雜精巧的功能也是通過生物分子間的協(xié)同應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)的,因此可以考慮采用兩種或者兩種以上的生物分子進(jìn)行復(fù)合,然后再對材料表面進(jìn)行修飾。侯悅等構(gòu)建了交聯(lián)的肝素/殼聚糖多層膜,發(fā)現(xiàn)該多層膜可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與生長。Chiu等在三維多孔膠原支架上同時共價固定了內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和血管發(fā)生蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時固定了兩種生物分子后的支架較單獨(dú)固定其中一種分子的支架的表面更能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管發(fā)生。因此,鑒于材料與細(xì)胞的相互作用是細(xì)胞膜表面受體與生物材料所提供的配體之間的相互間分子識別,產(chǎn)生特異性相互作用的過程,因此通過在基質(zhì)材料上涂覆、組裝或共混固定生物分子以提高材料的促內(nèi)皮化功能是一條可操作之路。另外,表面微圖形化也是一種促進(jìn)內(nèi)皮化的方法,正常的人體組織是有序化的結(jié)構(gòu),細(xì)胞在體內(nèi)呈現(xiàn)規(guī)則性、有序化的排列,因此,通過微圖形技術(shù),在生物材料表面模仿并構(gòu)筑類似于細(xì)胞生長的有序化微環(huán)境,是生物材料表面改性的重要技術(shù)手段。材料表面細(xì)胞圖形化分為兩種方式:一種是直接改變材料表面形貌如表面的粗糙度、孔洞的大小及分布和取向等,從而影響細(xì)胞的位點(diǎn)、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌、基因信號因子的表達(dá)和識別。研究發(fā)現(xiàn),條紋幾何形狀的表面有利于內(nèi)皮細(xì)胞的取向和運(yùn)動;另一種是綜合運(yùn)用物理、化學(xué)及微圖形制備方法,將促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的生物分子如纖連蛋白、層連蛋白、膠原以及細(xì)胞生長因子、合成功能短肽在基底材料上形成圖形分布,從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面也成圖形分布并促進(jìn)其在材料表面的粘附、鋪展和增殖。Li等采用軟刻蝕技術(shù)在Ti上制備了透明質(zhì)酸(HA)微圖形,研究了內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在該圖形上共培養(yǎng)的情況,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞比單獨(dú)培養(yǎng)的具有更好的生物學(xué)功能和抗內(nèi)膜增生功能,該研究為促內(nèi)皮化的心血管植入裝置提供了新的設(shè)計理念。3.3確保生物利用炎癥反應(yīng)可能會對醫(yī)療器械、假體或移植的生物材料的生物安全性產(chǎn)生影響。因此,在尤為重要的心血管材料的研究中,炎癥相容性也是生物相容性各種評價之一,但心血管生物材料領(lǐng)域炎癥相容性的研究還相對較少。目前,涉及抗炎癥功能的生物分子主要包括多肽類、肝素以及氨基酸聚合物等。Kao等從纖連蛋白中提取RGD和PHSRN多肽,在小鼠體內(nèi)研究它們在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用,結(jié)果證實(shí)多肽修飾的材料表面上有較小的炎癥反應(yīng),RGD和PHSRN在體內(nèi)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞行為方面具有時間和方向依賴性。Kim等在Ti表面共價接枝肝素,發(fā)現(xiàn)該表面在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的同時也達(dá)到了較好的抗炎癥效果,說明肝素化的材料表面具有優(yōu)異的炎癥相容性。Li等同樣在Ti表面固定了肝素和纖連蛋白的復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物具有較好的抑制巨噬細(xì)胞激活的功能,并可以顯著降低IL-1,TNF-α等炎癥因子的釋放。DeFife等發(fā)現(xiàn)在亮氨酸以及賴氨酸上構(gòu)建的PEA表面培養(yǎng)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞24h和7d后,其基質(zhì)中無論是促炎癥因子IL-6或是IL-1β的分泌都相對較少,說明采用氨基酸聚合物具有較好的抗炎癥效果。薛旸等研究了聚氨酯和聚四氟乙烯兩種血液接觸材料與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制,證實(shí)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生可能是材料激活單核細(xì)胞所致。補(bǔ)體系統(tǒng)是體內(nèi)的一個重要的宿主防御系統(tǒng),當(dāng)植入的導(dǎo)管、支架和心臟瓣膜等與血液接觸的時候,補(bǔ)體激活后會引起機(jī)體的炎癥反應(yīng),因此,通過抑制補(bǔ)體激活來減少機(jī)體的炎癥反應(yīng),也是目前材料生物相容性研究中一個重要的方向。Engberg等從鏈球菌M蛋白中提取M2-N,M4-N和M22-N,通過物理吸附固定在材料表面,對反應(yīng)基質(zhì)中的C4BP、C3、C4片段的含量進(jìn)行了酶免疫測定,結(jié)果測得各種片段的含量均有所下降,說明鏈球菌M蛋白中提取的肽段能結(jié)合C4BP,即通過抑制補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑來減少補(bǔ)體激活。另外,Andersson等對表面固定的H因子以及補(bǔ)體激活進(jìn)行了檢測,證實(shí)了H因子可通過抑制經(jīng)典激活途徑減少補(bǔ)體激活以抑制炎癥發(fā)生。4生物功能生物材料眾多研究發(fā)現(xiàn),在提高心血管植入物抗凝血性能的同時,往往會損失植入物的內(nèi)皮化性能,抗凝血和促內(nèi)皮似乎是一對不可調(diào)和的矛盾。但是,近幾年也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)了通過固定不同生物分子到材料表面而實(shí)現(xiàn)二者的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。一般認(rèn)為,纖粘連蛋白能夠增加EC的粘附生長,但也能夠促進(jìn)血小板的粘附,但Hubbell等發(fā)現(xiàn)從纖粘連蛋白得到的(Arg-GluAsp-Val)REDV肽共價連接到PET表面時,內(nèi)皮細(xì)胞粘附擴(kuò)展,而血小板卻未粘附;Coombes等將乳酸穩(wěn)定的白蛋白的納米微球注入滌綸的編織結(jié)構(gòu)后可促進(jìn)其內(nèi)皮化,并且可防止血小板的粘附;Meng等制備了肝素/殼聚糖的多層膜,動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該組裝膜具有較好的血液相容性和內(nèi)皮化性能。Chuang等將HA共價結(jié)合到PU表面,發(fā)現(xiàn)接枝了低分子量HA的表面不僅可以提高材料的血液相容性,而且可以極大地加速內(nèi)皮化,而高分子量的HA則不具備這兩種功能,說明分子量對生物分子的生物功能具有重要影響。Bos等發(fā)現(xiàn)材料上涂布白蛋白和肝素適宜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長,若材料上再結(jié)合上少量纖連蛋白,會進(jìn)一步促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。雖然接上纖連蛋白會減弱肝素抗凝活性,但由于提高了內(nèi)皮細(xì)胞的附著從而更好地改善了血液相容性。目前,針對無機(jī)血液接觸材料表面內(nèi)皮化與抗凝雙重修飾的研究還較少。由于生物分子種類繁多,將其固定在材料表面所用的引導(dǎo)物質(zhì)將各不相同,同時不同生物分子對不同材料的反應(yīng)性也不一致;另一方面,血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管最里面的一層襯里,其腔側(cè)面為帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜,吸附到此表面的蛋白質(zhì)種類繁多,而壁側(cè)面主要是帶錨狀纖維和小突起的支撐結(jié)構(gòu),使內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜甚至平滑肌細(xì)胞形成緊密連接;另外,血小板表面的細(xì)胞外衣中包含各種糖蛋白,而膜中又包含了對血小板激活起重要作用的多種酶和受體,因此,各種復(fù)雜的構(gòu)建和作用使得材料表面兼具促內(nèi)皮/抗凝生物化學(xué)修飾的研究任務(wù)異常艱巨,還需要解決諸多基本科學(xué)問題。此外,還有研究者通過物理(如吸附、共混等)或化學(xué)方法(如共價固定)在血管支架表面進(jìn)行攜載藥物的研究,包括抗凝血藥物(如肝素、水蛭素等)、抗增生藥物(如雷帕霉素、紫杉醇等)以及中藥提純物(如姜黃素、大黃素等)等。研究表明,通過攜載藥物,支架植入臨床患者后均不同程度的起到了抗凝、抗炎癥、阻止平滑肌細(xì)胞增殖、抑制組織增生和防止再狹窄的作用,獲得了具有多重生物學(xué)功能的表面。如Wang等在PU表面共價固定了水溶性的葡聚糖,研究發(fā)現(xiàn)固定了這種生物分子的PU表面不僅可以抑制血小板激活和纖維蛋白原吸附,并且減少了綠膿桿菌的吸附,采用這種生物分子修飾的表面不僅具備了抗凝血的性能,而且具有了抗菌抗炎癥的性能;Wang等研究了多層絲素纖維蛋白負(fù)載肝素分子的生物相容性,發(fā)現(xiàn)肝素分子的釋放過程可以顯著地抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和血小板的粘附,并且該載藥涂層具有較好的內(nèi)皮