代謝組學(xué)與中醫(yī)證候研究

代謝組學(xué)與中醫(yī)證候研究

作為中醫(yī)學(xué)獨(dú)特的識(shí)病方法，該綜合征是中醫(yī)辯證法的基礎(chǔ)和精髓，也是中醫(yī)理論、法律和法規(guī)的橋梁和關(guān)鍵。其實(shí)質(zhì)是人體在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中某一階段病理生理狀態(tài)的概括。目前中醫(yī)疾病證候辨證標(biāo)準(zhǔn)的建立方法為首先獲取辨證信息,然后通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或?qū)I(yè)知識(shí)判斷等方法建立辨證標(biāo)準(zhǔn),最后檢驗(yàn)辨證標(biāo)準(zhǔn)。雖在研究方法上取得了一定的進(jìn)展,但缺乏實(shí)質(zhì)性的突破。而代謝組學(xué)以其系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性、綜合性等特點(diǎn)與中醫(yī)證候的整體觀、恒動(dòng)觀、辨證觀思維模式有異曲同工之妙。代謝組學(xué)以代謝物群體作為標(biāo)志物來(lái)診斷疾病,使得中醫(yī)證候客觀化、科學(xué)化得到了方法學(xué)和技術(shù)上的支持。因此,將代謝組學(xué)方法與技術(shù)引入中醫(yī)證候本質(zhì)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1研究對(duì)象的特殊性代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,是“在新陳代謝的動(dòng)態(tài)進(jìn)程中,系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)”的一門(mén)科學(xué)。代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)把人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來(lái)研究,通過(guò)測(cè)定人體各種體液內(nèi)代謝物的組成變化來(lái)認(rèn)識(shí)和反映人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病和藥物作用下的變化規(guī)律,與中醫(yī)學(xué)的整體觀思維非常契合。中醫(yī)的證是對(duì)疾病某一階段的特定病理生理過(guò)程的認(rèn)識(shí),是機(jī)體內(nèi)因和環(huán)境外因綜合作用下的整體狀態(tài),并隨著病程發(fā)展而發(fā)生相應(yīng)的變化。而代謝組學(xué)的研究對(duì)象不是針對(duì)細(xì)胞、組織、體液某一時(shí)間點(diǎn),而是生命個(gè)體對(duì)外源性物質(zhì)的刺激、環(huán)境變化或遺傳修飾所做出的所有代謝應(yīng)答的全貌和動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,兩者的研究均具有恒動(dòng)觀思維。證不僅對(duì)疾病中致病因素這一共性有深刻的認(rèn)識(shí),更注重不同機(jī)體的反應(yīng)性,即注重辨證。代謝組學(xué)也認(rèn)識(shí)到這種個(gè)體差異,在某一病證相關(guān)特定組分的共性加以分析、判斷的同時(shí),又重視差異(發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物),即代謝組學(xué)亦具有辨證性。利用代謝組學(xué)研究中醫(yī)證候擺脫了西方還原論的束縛,從整體層面分析中醫(yī)證候的特點(diǎn),反映中醫(yī)證候的內(nèi)涵,高通量及無(wú)歧視的成分分析能夠快速解決中醫(yī)證候主觀對(duì)信息歧視的問(wèn)題,使中醫(yī)證候本質(zhì)客觀化。2中醫(yī)證候研究中醫(yī)治病講求辨證論治,而采用代謝組學(xué)技術(shù)研究不同證型、不同時(shí)間患者血液、體液中代謝物進(jìn)而確定證型所對(duì)應(yīng)的代謝組學(xué)特征和證候的物質(zhì)基礎(chǔ),使證得以科學(xué)化、客觀化、定量化的描述,不僅能提高中醫(yī)藥的臨床治療效果,更能促進(jìn)中醫(yī)證候本質(zhì)的研究。2.1基于臨床疾病綜合征的代謝研究2.2人類代謝的變化與人類代謝的變革亞健康是人體處于健康與疾病之間的一種狀態(tài)。研究亞健康形成過(guò)程中機(jī)體代謝及其代謝物的變化,探索潛在的生物標(biāo)志物,進(jìn)而了解亞健康的發(fā)生機(jī)制,有助于進(jìn)行亞健康的早期診斷與干預(yù)。3中醫(yī)證候?qū)W生物標(biāo)記物和代謝輪廓構(gòu)建符合中醫(yī)證候的病證結(jié)合動(dòng)物模型,采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)其生物樣本進(jìn)行研究,找到中醫(yī)證候的生物標(biāo)記物和代謝輪廓,進(jìn)而探究其作用機(jī)制,有利于進(jìn)一步闡明中醫(yī)證候的本質(zhì)并應(yīng)用于臨床診療。3.1ca、pls評(píng)分簡(jiǎn)維雄等采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制急性心肌梗死心血瘀阻證模型,并應(yīng)用GS-MS技術(shù)結(jié)合PCA、PLS分析模型組大鼠心肌組織代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),大鼠急性心肌梗死心血瘀阻證與心肌組織代謝產(chǎn)物蘋(píng)果酸、谷氨酸、酪氨酸等含量的改變密切相關(guān)。心肌組織代謝產(chǎn)物譜顯示急性心肌梗死心血瘀阻證代謝途徑與缺氧后的糖代謝紊亂密切相關(guān)。這些發(fā)生變化的代謝物可以作為心血瘀阻證的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行深入研究。3.2中醫(yī)證候研究王勇等采用NMR及NOESY(Nuclearoverhausereffectspectroscopy)序列核磁共振技術(shù)和模式識(shí)別技術(shù)研究冠心病心肌缺血血瘀證小型豬血清代謝物譜顯示,相對(duì)于假手術(shù)組,模型組血清中葡萄糖糖升高、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白降低,血液黏滯度升高,與中醫(yī)對(duì)血瘀證“濃、黏、凝、滯”的描述相符?？梢?jiàn),通過(guò)對(duì)證候相關(guān)代謝譜的研究,能夠?qū)χ嗅t(yī)證型進(jìn)行相關(guān)規(guī)范化研究。模型血清中內(nèi)源性代謝物檸檬酸、γ-氨基丁酸、乳酸等特定分子含量上升,提示其可能成為冠心病臨床診斷與治療的靶標(biāo),并為證候客觀化研究提供新的方法與思路。王勇還利用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)序列核磁共振技術(shù)研究去乳酸后慢性心肌缺血血瘀證小型豬血清差異代謝物的改變情況發(fā)現(xiàn)模型組血清中內(nèi)源性代謝物蘋(píng)果酸、谷氨酸、肌醇等含量上升,N-氧三甲胺等代謝物濃度下降。這些代謝物的特征組合模式可能成為慢性心肌缺血血瘀證臨床診療的參考指標(biāo),并為研究證候的客觀化提供新的思路。3.3pca檢測(cè)l-血酸、d-葡萄糖酸、丙氨酸、戊二酸含量潘秋等采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素制備糖尿病脾氣虧虛、痰瘀互阻證大鼠模型,并用GCMS和PCA技術(shù)分析第3、6周尿液發(fā)現(xiàn),第6周L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸、戊二酸含量較正常對(duì)照組和第3周增加。這些差異小分子物質(zhì)構(gòu)成了糖尿病“脾氣虧虛、痰瘀互阻證”的代謝標(biāo)志物群,成為了脾氣虧虛、痰瘀互阻證代謝水平上的物質(zhì)基礎(chǔ)。3.4-酮戊二酸及其他-內(nèi)酰胺-乙酸氧基的含量王偉明等利用NMR和PCA技術(shù)研究肝氣郁結(jié)證大鼠發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組大鼠尿液馬尿酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、異檸檬酸和鳥(niǎo)頭酸的含量降低,肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、煙酸和5-羥(基)吲哚-3-乙酸譜峰相對(duì)積分面積明顯增高,在尿液中的含量顯著升高。結(jié)果說(shuō)明尿液代謝組學(xué)的變化可以反映大鼠的生理病理基礎(chǔ),提示肝氣郁結(jié)證與三羧酸循環(huán)能量代謝糖酵解途徑受到影響密切相關(guān)。3.5生化產(chǎn)物的篩選鄒忠杰等運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究利血平所致脾虛大鼠血清和尿液代謝表型的變化,最終在血清中發(fā)現(xiàn)3-羥基丁酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/甲硫氨酸等12種標(biāo)志物,在尿液中發(fā)現(xiàn)檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等10種生物標(biāo)志物。這表明脾虛狀態(tài)下機(jī)體存在糖能量及氨基酸代謝紊亂。4研究數(shù)據(jù)的可重復(fù)性目前代謝組學(xué)在中醫(yī)疾病證候研究領(lǐng)域尚處于初級(jí)階段,雖然取得了一定的成果,但仍存在許多不足。如目前臨床研究樣本量較少,證候診斷標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,使得難以取得可重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。構(gòu)建的動(dòng)物模型難以得到行業(yè)的公認(rèn),傳統(tǒng)中醫(yī)的四診資料難以采集,相關(guān)代謝指標(biāo)和中醫(yī)證候間的對(duì)應(yīng)關(guān)系也存在疑問(wèn)。又如采用代謝組學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如何合理進(jìn)行分析。因此,在今后的研究中,從臨床和實(shí)驗(yàn)兩方面同時(shí)開(kāi)展證候研究,進(jìn)一步增加臨床樣本量,嚴(yán)格把握證候診療標(biāo)準(zhǔn),以保證研究結(jié)果的可重復(fù)性。并將代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法、技術(shù)進(jìn)行有效整合,才能真正實(shí)現(xiàn)對(duì)中醫(yī)證候整體、動(dòng)態(tài)、全面的把握,走出一條中醫(yī)證候研究的特色之路。2.1.1血漿代謝產(chǎn)物譜張紅栓等對(duì)10例痰濁證患者和10例血瘀證患者的血漿樣本進(jìn)行了1H-NMR(1H-NuclearMagneticResonance,氫核磁共振譜)檢測(cè),并用主成分分析PLS-DA(Partialleastsquaresdiscriminantanalysis,偏最小二乘判別分析)研究2組血漿代謝物圖譜的差異。1H-NMR圖譜模式分析顯示,2組血漿樣本代謝物差異顯著:痰濁證組低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂類物質(zhì)、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白含量均高于血瘀證組。研究表明痰濁證的脂代謝和糖代謝均較血瘀證紊亂,提示血漿代謝物變化在一定程度上能區(qū)分冠心病心絞痛的不同證型。張紅栓還研究了血瘀證與痰濁證患者的尿液代謝產(chǎn)物譜發(fā)現(xiàn):血瘀證組尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸、葡萄糖、3-羥基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、馬尿酸含量低于痰濁證組,膽汁酸、組氨酸高于痰濁證組。研究顯示尿液代謝物中小分子的變化一定程度上可以作為不同證型的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.1.2高血壓病的組織病理學(xué)楊傳華等采用LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)技術(shù)對(duì)12例高血壓病肝陽(yáng)上亢證和14例陰陽(yáng)兩虛證患者血漿進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示肝陽(yáng)上亢證組雌二醇、白三烯、葡萄糖神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺相對(duì)增多,而陰陽(yáng)兩虛證組中甘油三酯和甘油二酯相對(duì)增多。該結(jié)果提示以上六種可以成為兩種高血壓證候的臨床診斷鑒別點(diǎn)。蔣海強(qiáng)等對(duì)10例高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者及12名健康志愿者的尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸、去甲腎上腺素、泛酰巰基己胺等15個(gè)潛在代謝標(biāo)志物,揭示了肝陽(yáng)上亢證可能與磷脂代謝、脂肪酸代謝和花生四烯酸代謝異常相關(guān)。蔣海強(qiáng)等還采用GC-MS(Gaschromatograph-massspectrometer,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)技術(shù)分析9例高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者及11例健康志愿者尿液發(fā)現(xiàn)硬脂酸、肌醇、D-果糖和鄰苯二甲酸等潛在生物標(biāo)志物,揭示了肝陽(yáng)上亢證可能與氨基酸代謝、磷酸肌醇代謝、脂肪酸代謝及糖代謝異常相關(guān)。范群麗等對(duì)高血壓病肝火亢盛型24例、痰濕壅盛型15例、陰虛陽(yáng)亢型17例患者及21例標(biāo)準(zhǔn)健康人血清進(jìn)行了氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于健康人,尿酸、尿素和肌酐醇較高,氨基酸、小分子有機(jī)酸、脂肪酸類、脂類及糖醇類較低。該研究提示健康人與高血壓病人及高血壓病不同證型之間存在物質(zhì)基礎(chǔ)差異。2.1.3血清氨基酸及-葡萄糖的變化尤麗等對(duì)33例腎虛痰瘀型2型糖尿病患者和50例健康人血清進(jìn)行核磁共振氫譜分析,結(jié)果顯示腎虛痰瘀型2型糖尿病患者與健康人相比血清中多種氨基酸顯著降低,乳酸、檸檬酸、肌酸及肌酸酐也較健康人顯著降低。同時(shí),α-葡萄糖及β-葡萄糖較健康人增加。研究結(jié)果提示,腎虛痰瘀型2型糖尿病患者代謝成分與健康人存在顯著差異,其作用機(jī)制可能是腎虛痰瘀型2型糖尿病患者體內(nèi)的三羧酸循環(huán)及糖酵解途徑被抑制,蛋白質(zhì)代謝異常,支鏈氨基酸代謝增強(qiáng),這些將有助于闡明糖尿病證候的形成。2.1.4中醫(yī)證候?qū)W意義張一博等采用GC-MS技術(shù)對(duì)31例慢性乙肝肝氣郁結(jié)證患者、對(duì)照組16例肝血瘀證患者及30例健康人的血清進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比,肝氣郁結(jié)證患者有差異明顯的代謝物質(zhì),但與對(duì)照組肝血瘀證患者代謝物質(zhì)的差異性PCA(Principalcomponentanalysis,主成分分析)分析提示,得分圖上有一定分離趨勢(shì),但并不能完全分開(kāi)。研究結(jié)果說(shuō)明中醫(yī)證候是有其生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的。郭孜等采用GC-MS技術(shù)的尿液衍生化方法,分析乙肝后肝硬化患者濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、肝腎陰虛證等不同證候內(nèi)源性小分子代謝物發(fā)現(xiàn),與正常人比較,乙肝后肝硬化患者存在大量的與能量代謝和氨基酸代謝通路有關(guān)的差異性尿代謝物,主要包括丙二酸、苯酚、纈氨酸等。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)與健康人相比,濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者亮氨酸和纈氨酸成升高趨勢(shì),而肝腎陰虛證無(wú)顯著性差異。研究表明,乙肝肝硬化不同證候具有不同的代謝模式,而這些潛在標(biāo)志物群可以作為臨床區(qū)分不同證型的生物學(xué)標(biāo)志。王喜軍等采用超高效液相色譜-時(shí)間飛行質(zhì)譜結(jié)合PCA等分析技術(shù)對(duì)黃疸型肝炎及陰黃證和陽(yáng)黃證兩個(gè)亞型患者的尿液進(jìn)行研究顯示,相對(duì)于正常人,黃疸綜合征組有腎上腺素等44個(gè)差異性代謝物,陽(yáng)黃證有激動(dòng)素等40個(gè)差異性代謝物、陰黃證有α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺等差異性49個(gè)代謝物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),陽(yáng)黃證的形成可能與維生素B6、精氨酸、脯氨酸及色氨酸的代謝異常有關(guān),陰黃證的機(jī)制可能涉及類固醇激素的生物合成、初級(jí)膽汁酸合成及半胱氨酸蛋氨酸代謝紊亂有關(guān)。該研究為陽(yáng)黃證和陰黃證的證候客觀化提供新的思路。2.1.5艾患者與健康對(duì)照組患者的山液代謝產(chǎn)物代謝譜比較謝世平等采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合PCA方法分析、比較12例艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者脾肺氣虛證者和8例健康對(duì)照者的尿液代謝產(chǎn)物代謝譜的差異,結(jié)果表明代謝組學(xué)研究方法可以將艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者脾肺氣虛證者脾肺氣虛證者的尿液代謝輪廓與健康對(duì)照組進(jìn)行良好的區(qū)分,為診斷提供一定的客觀依據(jù)。2.2.1代謝產(chǎn)物譜檢測(cè)崔海珍等采用1H-NMR結(jié)合PLS分析研究亞健康肝郁證