蛋白的分離純化詳解

一、蛋白質(zhì)的分離純化概述與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性分子大小分子形狀帶電特性溶解特性與配體特異性結(jié)合不同吸附性質(zhì)變性和復(fù)性哪些技術(shù)、原理分子大小重點大?。旱鞍踪|(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。常用方法透析超濾凝膠過濾離心分子形狀重點形狀：蛋白質(zhì)在離心通過溶液、膜、凝膠顆?；螂娪灸z中的小孔運動時，都會受到它的形狀的影響。方法密度梯度離心電泳分子篩層析（三格寫，兩格不寫）電荷原理：蛋白質(zhì)的凈電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負電荷總和。方法電泳離子交換層析溶解度原理：由于蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團不同，因此在溶劑中的溶解度不同。方法：鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法配體特異性結(jié)合重點原理：將具有親和結(jié)合的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，來分離另一個分子。分類免疫親和層析生物親和層析金屬螯合親和層析擬生物親和層析吸附性質(zhì)原理：根據(jù)次級鍵相互作用。方法：吸附層析變性和復(fù)性原理：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性等稱為變性。當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能即為復(fù)性。方法：尿素變性復(fù)性從包涵體中純化原核表達蛋白二、蛋白質(zhì)的分離純化細胞破碎蛋白溶解酸、堿醇去垢劑尿素……粗提沉淀相分離分子篩……精提各種色譜電泳分離差速離心……研磨超聲滲透壓酶……保存預(yù)處理（沉淀）原材料的獲取濃縮保存狀態(tài)保存條件保存期限……分離純化流程純化分離純化流程預(yù)處理（沉淀、粗分離）-純化（離子交換）機械方法：攪拌、振動研磨壓濾超聲勻漿非機械方法：干燥滲透壓凍融酶細胞破碎體積離子強度

pH溫度蛋白質(zhì)的穩(wěn)定蛋白的溶解蛋白質(zhì)的粗分離使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時去除大量的雜質(zhì)，這些純化方法就屬于蛋白質(zhì)的粗分級。硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級沉淀、超速離心、等電點沉淀(重點)、透析、超過濾、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。蛋白質(zhì)的純化粗分離只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進一步純化，這就是蛋白質(zhì)細分級。常用的實驗技術(shù)：層析（離子交換等）和電泳1.離子交換層析固相支持物：纖維素、瓊脂糖、葡聚糖等高分子聚合物帶電基團：羧甲基、二乙基氨基等平衡離子：H+,Na+,Cl-,OH-

基本操作過程樣品制備，裝柱與平衡上樣（樣品溶解于A液中）洗脫：穿透峰，洗脫峰收集、鑒定離子交換層析有兩種洗脫方式分步洗脫：用間斷地遞增的不同離子強度的流動相分次洗脫樣品蛋白的方法；梯度洗脫：連續(xù)改變流動相離子強度的方法。目前隨著層析的自動化，梯度洗脫成為大多數(shù)情況下的首選方案。2.凝膠過濾層析利用分子量不同的蛋白質(zhì)，通過凝膠分子篩時速度不同來分離蛋白質(zhì)的方法。常用的凝膠有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。3.親和層析以樣品的生物活性為依據(jù)的分離方法。生物分子的特點是有專一的活性，如酶與底物的結(jié)合，抗原與抗體，激素與受體，糖與凝集素……等。將上述作用體系的一方連接到層析基質(zhì)上，使之固定化，就有可能分離純化專一作用的另一方。各種用于抗體識別的標(biāo)記His-tag(6-8Histidine)鎳離子-6個組蛋白T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL)免疫親和層析：將蛋白質(zhì)抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原蛋白的純化；凝集素親和層析：凝集素是一大類能專一性和糖類和糖復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，固定化凝集素可用于糖蛋白純化；染料親和層析：有多種染料可與各種類型的酶結(jié)合，又不受酶的作用，可用于多種蛋白的分離。親和層析中的三大通用技術(shù)電泳（electrophoresis）帶電粒子在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)在電場中泳動時，受到電場力和摩擦力兩種方向相反的力的作用蛋白質(zhì)因帶電、大小和形狀不同而在直流電場中泳動速度不同。常用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing-IEF）雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（bis）經(jīng)共聚合而成，此過程在TEMED和過硫酸銨催化下聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠的孔徑可在較寬范圍內(nèi)變化，以迎合不同的分離需要。根據(jù)凝膠的均勻性（孔徑、pH）可分為連續(xù)與不連續(xù)兩類；根據(jù)是否加蛋白質(zhì)變性劑，可分為變性與非變性兩類；根據(jù)是否加還原劑2-巰基乙醇或DTT，可分為還原與非還原兩類；還可根據(jù)電泳裝置的不同，分為圓盤電泳和平板電泳。PAGE的分類不連續(xù)平板PAGE，是使用最廣泛的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)，它由濃縮膠與分離膠兩部分組成。不連續(xù)PAGE有很高的分辨力，因為它有以下三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)不連續(xù)PAGE染色法：考馬斯亮藍染色法（多種類型可選）、銀染法；活性檢測法：適用于NativePAGE，其中蛋白質(zhì)保持天然活性，可用酶學(xué)方法檢測；免疫印跡法：用特異性抗體檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。PAGE的檢測方法2.等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點進行分離的一種技術(shù)?；驹恚豪脙尚噪娊赓|(zhì)載體形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，使pH從正極到負極逐漸增加。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH位置帶電，因此在電場中可以移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到pH等于pI位點，其靜電荷為0，在電場中不再移動，據(jù)此可將不同pI的蛋白質(zhì)分離。優(yōu)點樣品加樣位置和體積不受限制；分辨率高于其它類型電泳；可測定pI值；缺點樣品在pI區(qū)域易沉淀，為增加樣品溶解度，可以在膠中加入尿素，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活；樣品前處理麻煩。等電聚焦的優(yōu)缺點3.雙向電泳（概念、原理、作用、用途）將等電聚焦技術(shù)與SDS技術(shù)組合起來的新技術(shù)，是目前分離蛋白質(zhì)混合物最強大的技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)?；静襟E：第一相等電聚焦后，在等電聚焦的垂直的方向進行第二相SDS。雙向凝膠電泳的原理：第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。應(yīng)用凝膠中蛋白的檢測圖像采集和分析蛋白鑒定分離蛋白質(zhì)組所有蛋白（1）

IEF等電聚焦電泳（2）SDS（3）染色脫色pH3-----10圖像分析在用雙向電泳進行差別表達蛋白質(zhì)組分析時，需要利用軟件對產(chǎn)生的2D膠進行差別分析，以尋找差別表達蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的ImageMaster2DElite或ImageMaster2DPlanium分析軟件。蛋白質(zhì)的濃縮超濾法冷凍干燥法沉淀法三、蛋白質(zhì)的鑒定

1.蛋白質(zhì)的含量測定

2.蛋白質(zhì)分子量的測定

3.蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)蛋白質(zhì)的含量測定目前蛋白質(zhì)的直接定量分析技術(shù)只能測定樣品的總蛋白含量；目前沒有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是凱氏定氮法，LowryFolin法、考馬斯亮藍法、紫外分光光度法等。3.蛋白質(zhì)分子量的測定

SDS測定分子量

凝膠過濾層析法測定分子量

質(zhì)譜法1.SDS測定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS）和蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶的負電荷的量遠遠超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。2.凝膠過濾層析法測定分子量蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示：lgMr＝K1－K2

Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準物的Ve，并以它們的lgMr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。SDS與凝膠過濾法是互補的凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在