抗癌藥物多糖

抗癌新秀－多糖的研究進展多糖研究的歷史1855年ClaudeBernard鑒定了“肝的原樣物質(zhì)”是葡萄糖的一種儲藏形式。1923年M.Heidelberger和T.Oswald提出細(xì)菌的抗原部分是由糖類物質(zhì)組成而不是蛋白質(zhì)。1936年Shera實驗證實多糖有抗腫瘤作用。1958年Brander報道了酵母細(xì)胞壁多糖(Zymosan)具有抗腫瘤活性。多糖研究的歷史1969年日本學(xué)者千原郎首次報道了從香菇子實體中分離出一種抗腫瘤多糖(lentinan,LNT)。1988年DwekRademache和Parekh首先創(chuàng)立了“糖生物學(xué)(glycobiology)”。2003年美國《TechnologyReview》刊文稱,在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后,糖組學(xué)(glycomics),有望取得突破性進展。多糖的概念多糖是一類由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物,廣泛分布于多種生物體中,尤其是動物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁中,是構(gòu)成生命的分子基礎(chǔ)之一。糖生物學(xué)的概念研究自然界廣泛分布的糖類(糖鏈和聚糖)及其結(jié)構(gòu)、生物合成及生物學(xué)的一門學(xué)科。它是生物醫(yī)學(xué)各學(xué)科中在基礎(chǔ)研究、生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面發(fā)展較快的一門學(xué)科。糖生物學(xué)的研究不僅需要糖類的命名、生物合成、結(jié)構(gòu)、化學(xué)合成的基礎(chǔ)研究，還需要分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)、基因組學(xué)、生理學(xué)等方面的基礎(chǔ)研究。糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義糖組被定義為單一生物體中全部聚糖的總稱。糖組學(xué)則是研究糖組結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)。糖組和糖組學(xué)是兩個不同的概念，糖組是了解一個生物體在某種情況下所具有的全部聚糖種類，而糖組學(xué)是對聚糖與蛋白質(zhì)間相互作用和功能的全面分析研究，包括糖組的結(jié)構(gòu)鑒定、編碼糖蛋白的基因和蛋白質(zhì)糖基化的機制和功能等。糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義糖分子多以糖蛋白或其它結(jié)合物形式存在于細(xì)胞的任何部位，糖與蛋白質(zhì)問的相互作用能介導(dǎo)細(xì)胞問相互反應(yīng)的基本過程，如細(xì)胞的增殖、吸附、識別和免疫等功能。糖組學(xué)研究是定義復(fù)雜生命系統(tǒng)和細(xì)胞體系必不可少的，如果在糖組概念下，能夠闡明聚糖結(jié)構(gòu)的差異與個體、發(fā)育、疾病等的關(guān)聯(lián)性，就可以定義糖的功能和它們存在的目的。糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義人類基因組序列的破譯極大地鼓舞了人們要迅速闡明基因功能和識別以基因組為基礎(chǔ)的潛在藥物靶標(biāo)的熱情，并啟動了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但很快發(fā)現(xiàn)以目前的知識水平根本無法搞清基因表達、蛋白質(zhì)活性和細(xì)胞功能問的相互關(guān)系。事實上，基因產(chǎn)物在表達水平上與其基因是不同的。糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義大量證據(jù)已證實人類基因組約有3－6萬條基因，但人類蛋白質(zhì)組卻可能有100多萬種蛋白，這種差別主要是由蛋白質(zhì)翻譯后修飾引起的，其中最普通和最多樣的翻譯后加工是蛋白質(zhì)糖基化，大約有一半以上的天然蛋白都是糖蛋白。糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義糖在生物過程中具有其它生物分了所不可替代的作用，但由于糖的結(jié)構(gòu)多樣性目且不是基因的直接產(chǎn)物，所以，迄今尚沒有闡明糖的生物功能，而有關(guān)蛋白質(zhì)糖基化的功能及其分析方法也有很多問題尚待解決，這些都是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)所無法實現(xiàn)的。因此糖生物學(xué)家在20世紀(jì)末提出了糖組和糖組學(xué)概念，并得到科學(xué)家們的廣泛認(rèn)同，在后基因組時代的生命科學(xué)研究中成為新的前沿和熱點.糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義糖組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白組學(xué)后的新興研究領(lǐng)域，它的研究結(jié)果直接關(guān)系到是否能夠闡明基因功能及細(xì)胞功能。這是因為:第一，所有的生命體都是由細(xì)胞組成，而其表面都被各種形式的聚糖所包被，幫助我們識別細(xì)胞類型和狀態(tài)。但與蛋白質(zhì)不同，單從基因組信息無法預(yù)測最終的聚糖結(jié)構(gòu)，因此，迫切需要開發(fā)新的糖組學(xué)研究手段和思路以分析糖組結(jié)構(gòu)和功能。糖組學(xué)及在生命科學(xué)研究中的意義第二，就像磷酸化一樣，糖基化是所有真核蛋白質(zhì)翻譯后加工的一種形式，但蛋白質(zhì)糖基化遠(yuǎn)較單一結(jié)構(gòu)形式的磷酸化復(fù)雜得多，因此聚糖研究存在各種技術(shù)困難，蛋白質(zhì)組學(xué)中的大多數(shù)方法不適用糖基化研究。第三，按醫(yī)學(xué)觀點聚糖研究非常實用，細(xì)胞表面聚糖是生物體所必需的，可以避免各種微生物對寄主細(xì)胞的感染。色譜柱洗脫，苯酚-硫酸法測定糖含量，根據(jù)結(jié)果合并流分多糖提取分離與純化流程圖

原料

蛋白多糖中性酶法、Sevag法除蛋白總多糖多糖流分濾液多糖組分透析膜透析冷凍干燥水煎醇沉多糖的分離純化多糖的提取預(yù)處理提取之前用石油醚、乙醚等溶劑除去脂溶性雜質(zhì)；用85％乙醇除去單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分。提取多糖通常用水作溶劑來提取。還可利用混合溶劑提取法對植物中不同的多糖進行分離。根據(jù)多糖的溶解性可以用超濾離心分離法提取多糖。對于蛋白多糖，可利用加酶提取法提取多糖。多糖的分離純化除蛋白傳統(tǒng)上有Sevag法、三氟三氯乙烷法及三氯乙酸－正丁醇法等。另外，也可以在多糖的水提液中加入中性蛋白酶和糜蛋白酶，與有機溶劑結(jié)合進行脫蛋白。除蛋白的效果可以用茚三酮反應(yīng)檢測，結(jié)果呈陰性；同時在200～280nm處測定除蛋白后樣品的紫外吸收曲線來檢測效果，除掉蛋白質(zhì)的多糖溶液一般在260～280nm的紫外吸收峰會消失，說明多糖不含有蛋白。多糖的分離純化除色素可以用食品級粉末狀活性炭吸附；也可以用雙氧水對色素的有色基團產(chǎn)生破壞而除去色素；還可以用大孔吸附樹脂柱層析脫去色素，這個方法還可以使多糖混合組分初步分離。多糖的分離純化多糖含量測定測定還原性多糖的方法有3，5－二硝基水楊酸鹽(DNS)比色法和Somogyi－Nelson法。另一類測定方法是利用多糖在強酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，然后再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)這一性質(zhì)進行測定，這類方法有地衣酚－硫酸法、苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法。苯酚－硫酸法是用得較多的方法。多糖的分離純化多糖的純化最常用的純化多糖的方法是色譜法，包括離子交換色譜如DEAE－纖維素和凝膠色譜如葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）。實驗中常將粗多糖經(jīng)色譜柱洗脫，按洗脫曲線的不同峰收集不同的組分，從而分級得到各個均一多糖成分。多糖的分離純化純度鑒定測定方法有功能團分析、比旋光度、紙色譜和高效液相色譜(HPLC)、高壓電泳、超濾離心分析法等，其中色譜法和電泳法較常用，其中色譜法常用的有柱色譜和HPLC等。電泳鑒定純度的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、玻璃纖維紙電泳和醋酸纖維膜電泳等。若為純品，則在色譜柱中洗脫后得單一對稱峰，電泳后會得單一斑點。

多糖的結(jié)構(gòu)分析相對分子質(zhì)量測定常用的方法有凝膠色譜法、蒸汽壓滲透計法、端基法、粘度法、光散射法、滲透壓法和超濾法等。凝膠色譜法是比較常用的方法，用已知分子量樣品作標(biāo)準(zhǔn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測多糖的相對分子質(zhì)量。多糖相對分子質(zhì)量只代表相似鏈長的平均而不是確切的分子大小。往往用不同的方法會得到不同的相對分子質(zhì)量。

多糖的結(jié)構(gòu)分析化學(xué)分析方法

酸水解鑒定多糖的單糖組成常用的方法。甲基化法闡明單糖的連接方式(鍵型)、重復(fù)結(jié)構(gòu)中某種單糖的數(shù)目、末端糖的性質(zhì)及分支點的位置等。過碘酸氧化確定多糖中各種單糖的鍵型及其比例。Smith降解

闡明多糖中單糖的部分連接順序和鍵型。多糖的結(jié)構(gòu)分析物理分析方法

紫外光譜法檢測多糖中是否含有蛋白質(zhì)、核酸、多肽類。紅外光譜法確定吡喃糖的苷鍵構(gòu)型及常規(guī)觀察其他官能團。氣相色譜法分析多糖水解后單糖的組成及比例。核磁共振光譜法主要用于確定多糖結(jié)構(gòu)糖苷鍵的構(gòu)型以及重復(fù)結(jié)構(gòu)中單糖的數(shù)目。質(zhì)譜法鑒定各種甲基衍生物的碎片、確定各種單糖殘基的連接位置。電噴霧電離質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜和快原子轟擊質(zhì)譜還可以測定糖鏈的相對分子質(zhì)量及糖鏈的一級結(jié)構(gòu)。多糖的結(jié)構(gòu)分析生物學(xué)方法酶學(xué)方法即利用各種特異性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再與其他定性、定量方法聯(lián)用推測多糖的結(jié)構(gòu)。免疫學(xué)方法根據(jù)多糖抗原與蛋白質(zhì)抗體的特異性，制備對抗未知多糖的抗體，來闡明未知多糖的結(jié)構(gòu)。

多糖的藥理作用免疫調(diào)節(jié)作用是多糖最主要和最重要的生物活性之一。目前己發(fā)現(xiàn)100多種中藥多糖具有免疫促進作用。這些多糖通過對機體的細(xì)胞免疫、體液免疫和對補體系統(tǒng)、細(xì)胞因子的影響而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。香菇多糖體內(nèi)給藥能誘生IFN。柴胡多糖、刺五加多糖、羧甲基茯苓多糖、平蓋靈芝多糖和銀耳多糖等都能誘生干擾素。莪術(shù)多糖、三七多糖可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-a。云芝多糖可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-a基因的表達。多糖的藥理作用抗腫瘤活性大量的研究表明，中藥多糖具有肯定的抗腫瘤作用，且?guī)缀鯖]有毒性。香菇多糖、裂褶菌多糖、豬苓多糖、云芝多糖等一批質(zhì)量穩(wěn)定、療效確切、毒性和不良反應(yīng)小的多糖類藥物已用于臨床。香菇多糖除對移植癌的生長有抑制作用外，對原發(fā)性自身癌的生長有強抑制作用，對化學(xué)致癌及病毒致癌也有抑制效果。對于不能手術(shù)或再發(fā)性胃癌患者，與氟脲嘧啶并用，可延長生存期。目前臨床上使用的均為從菌類等低等植物中提取的多糖。近年來，越來越多的具有抗腫瘤作用的高等植物多糖也被發(fā)現(xiàn)，如:苦楝多糖、桔梗多糖、庫拉索蘆薈多糖、黃皮樹多糖，海棗多糖等。多糖的藥理作用降血糖活性研究表明，一些多糖能夠促進胰島分泌胰島素，影響糖代謝酶的活性，抑制糖異生，而產(chǎn)生降血糖作用。薏苡仁多糖能顯著降低正常小鼠及四氧嘧啶和腎上腺素所致的高血糖小鼠的血糖。人參多糖有降血糖作用。香菇胞外多糖可顯著降低鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血漿中的Glc、總膽固醇和二酰甘油水平。多糖的藥理作用抗病毒活性硫酸葡聚糖、角叉菜膠、肝素、硫酸軟骨素等對艾滋病病毒(HIV)具有抑制作用，這些多糖大都含有硫酸基。1987年，德國Bayer公司研制的木聚糖硫酸酯對愛滋病有較好的療效?？茖W(xué)家們還進一步發(fā)現(xiàn)硫酸化多糖能從多個環(huán)節(jié)和步驟干擾HIV對宿主細(xì)胞的侵襲，并對HIV有很高的選擇性抑制作用。甘草多糖對牛艾滋病毒BIV、腺病毒、柯薩奇病毒均有較明顯的抑制作用。中藥夏枯草中分離出來的硫酸化多糖具有顯著抗HIV的作用。多糖的藥理作用抗衰老活性由于多糖類化合物可以增強機體的免疫功能，可作為自由基清除劑，在一定程度上延緩衰老，防治老年病。如刺五加多糖可延長果蠅平均壽命11.7-30%；枸杞多糖可延長家蠶五齡期壽命14%。此外，具有抗衰老作用的還有香菇、銀耳、黑木耳、猴頭菌、波葉大黃、黃芪、紅芪、人參等生藥中的多糖。多糖的藥理作用防治動脈粥樣硬化作用研究發(fā)現(xiàn)，多種多糖具有抗凝血和降血脂的活性，可使動脈粥樣硬化病程減慢、病變減弱、已形成的病變停止發(fā)展，起到防治動脈粥樣硬化的作用。(1)降血脂：南瓜多糖可升高正常及糖尿病小鼠的高密度脂蛋白。茶葉多糖可增強卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的活性，有利于膽固醇的清除。枸杞多糖對實驗性高脂血癥大鼠的血脂有明顯影響，可顯著降低血清膽固醇、甘油三酯含量，而對高密度脂蛋白有升高作用。(2)抗凝血：多種硫酸多糖，如藻酸、昆布多糖、海帶多糖等具有抗凝血作用。這些多糖可通過抑制凝血蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，產(chǎn)生抗凝血作用。(3)降血壓：皮果衣多糖、褐藻多糖具有降壓作用。多糖的抗腫瘤作用機理免疫調(diào)節(jié)作用人參多糖能增強吞噬細(xì)胞能力，并誘導(dǎo)機體效應(yīng)細(xì)胞IL-1,IL-2,INFmRNA的表達，增強LAK細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的活性，提高機體抗腫瘤的能力。巴戟天多糖能促進小鼠體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞釋放TNF-a,IL-1、IFN-Y,IL-10等細(xì)胞因子，與阿霉素、順鉑、5一氟脲嘧啶及長春新堿等化療藥物合用能明顯提高荷瘤小鼠的存活率和生存時間。云芝多糖能誘導(dǎo)1L-2,IFN等的產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖，減少轉(zhuǎn)化生長因子的產(chǎn)生。在體內(nèi)外均有抑制食道癌、胃癌、肺癌等細(xì)胞增殖的作用，減輕患者化療并發(fā)癥，對由環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞減少和遲發(fā)型超敏反應(yīng)有抑制作用。多糖的抗腫瘤作用機理對腫瘤細(xì)胞的直接抑制或殺傷作用改變腫瘤細(xì)胞周期茯苓多糖使乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞生長阻滯于細(xì)胞周期G1期，此作用與下調(diào)細(xì)胞周期素(cyclin)D1和cyclinE的表達有關(guān)。枸杞多糖作用于人肝癌細(xì)胞QGY7703后，可使腫瘤細(xì)胞的生長明顯阻滯于S期。此外，桑黃多糖可使人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的生長阻滯于G2/M期。多糖的抗腫瘤作用機理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡茯苓葡聚糖可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡；桑黃多糖可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡，且隨著劑量的增加，凋亡率明顯提高；枸杞多糖可明顯誘導(dǎo)人肝癌QGY7703細(xì)胞的凋亡；此外，羊棲菜多糖可誘導(dǎo)大腸癌lovo細(xì)胞凋亡，銀杏多糖可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡，分枝石蕊多糖可誘導(dǎo)人白血病K562和HL-60細(xì)胞的凋亡。多糖的抗腫瘤作用機理對細(xì)胞生化代謝的影響(１)對細(xì)胞膜組分的影響刺五加多糖、茯苓多糖和牛膝多糖對肉瘤S-180細(xì)胞增殖有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種多糖不僅使細(xì)胞膜表面唾液酸SA含量明顯升高，而且還引起膜磷脂、花生四烯酸和豆蔻酸降低。(２)對磷脂酰肌醇((PI)轉(zhuǎn)換的影響刺五加多糖、茯苓多糖均有抑制腫瘤細(xì)胞K562PI轉(zhuǎn)換的作用。多糖的抗腫瘤作用機理對腫瘤細(xì)胞端粒酶的影響發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能抑制HL-60細(xì)胞的增殖，降低HL-60細(xì)胞的端粒酶活性，且這兩種作用均呈濃度和時間依賴性。分枝石蕊多糖可劑量依賴性的降低人白血病HL-60的端粒酶活性，對腫瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。多糖的抗腫瘤作用機理對癌基因的影響地黃多糖可明顯增加Lewis肺癌細(xì)胞p53基因的表達，與抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的肺癌組織內(nèi)p53基因表達水平相似。分枝石蕊多糖對HL-60細(xì)胞可明顯增加Bax,Fas和FasL的表達，對Bcl-2的表達無明顯影響。另外，桑黃多糖具有誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的作用，此作用與其抑制原癌基因Bcl-2表達有關(guān)。多糖的抗腫瘤作用機理清除自由基作用海帶硫酸多糖能激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，提高腹腔巨噬細(xì)胞的過氧化物酶活性及其吞