金藻基因組dna提取方法的研究

金藻基因組dna提取方法的研究

大多數(shù)金屬藻沒有完整的毛囊，富含脂肪酸和營養(yǎng)價值。這是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)飼料，但也有一些品種能形成赤潮，嚴(yán)重?fù)p害了中國的水產(chǎn)養(yǎng)殖和水環(huán)境。我國常見的金藻以巴夫藻屬、等鞭金藻屬和棕囊藻屬的種類為主,其中前兩個屬的種類是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的常用優(yōu)質(zhì)餌料,棕囊藻屬的種類是我國赤潮的常發(fā)生種,它們與我國水產(chǎn)養(yǎng)殖和水域環(huán)境關(guān)系密切。近年來有關(guān)金藻的營養(yǎng)、餌料價值研究較多,但是有關(guān)其系統(tǒng)學(xué)研究的報道較少,使用方法主要以傳統(tǒng)的形態(tài)分類為主。由于金藻在保存和培養(yǎng)時形態(tài)特征容易發(fā)生變化,且部分分類標(biāo)準(zhǔn)易受外界環(huán)境的影響等,故目前金藻的分類系統(tǒng)比較混亂。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,應(yīng)用基因或DNA序列進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析,為金藻分類系統(tǒng)的重建提供了有力的理論依據(jù)?；蚪MDNA的提取是獲得基因或DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的前提,直接決定著PCR擴(kuò)增、酶切、克隆等實驗的進(jìn)行,因此,尋找一種快速、簡便、廉價的獲得高質(zhì)量基因組DNA的DNA提取方法,對于金藻分子領(lǐng)域研究的廣泛開展非常必要,并且目前有關(guān)金藻DNA提取的文章也非常少。本文以金藻類餌料藻類綠色巴夫藻和赤潮藻類球形棕囊藻作為研究金藻DNA提取方法的實驗對象,并以葉綠體光合作用PSⅡ反應(yīng)中心復(fù)合物(D1-D2-Cy559)的D1(32KD)蛋白的編碼基因——psbA基因的PCR擴(kuò)增效果對不同方法提取的基因組DNA進(jìn)行檢測,以期為我國金藻類分子系統(tǒng)學(xué)研究工作的開展做好前期準(zhǔn)備工作,同時也希望能夠獲得一種快速、簡便、高效的DNA提取方法。1材料和方法1.1多樣性系藻種室球形棕囊藻(Phaeocysitisglobosa)由香港大學(xué)生物多樣性系藻種室提供,采自香港將軍澳水域。綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)來自暨南大學(xué)水生所藻種室。藻種采用F2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為20℃,光照強(qiáng)度為4000lux,光暗比為12h∶12h。1.2樣品處理和純化DNA提取的藻液為實驗室培養(yǎng)的等量新鮮藻液。為區(qū)分起見,4種DNA提取方法分別命名為高鹽法、PVP法、玻璃粉法和CTAB法。其具體步驟如下。(1)高鹽法:參考Salah等的方法,并做部分修改。藻液經(jīng)過離心濃縮后,加入400μLSDS(十二烷基磺酸鈉)提取緩沖液(0.2mol/LTris-HClpH值8.0,25mmol/LEDTApH值8.0,0.25mol/LNaCl,0.5%SDS)和8μL20mg/mL的蛋白酶K,55°C水浴2h,離心后,上清加入300μL的6mol/LNaCl,搖均,10000r/min離心30min,上清加入等體積的異丙醇,-20°C沉淀1h以上,沉淀用70%的酒精沖洗兩次,無水乙醇洗一次,室溫下晾干,加入50μLTE溶液溶解。-20°C保存,備用。(2)PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)法:參考Kim等的方法,并做部分修改。前期步驟如(1),樣品經(jīng)SDS提取緩沖液消化離心后,上清加入200μL10%的PVPk30和0.5倍體積的7.5MNH3Ac,冰浴30min,10000r/min離心10min,上清加入等體積的異丙醇,-20℃放置30min,10000r/min離心10min,沉淀用70%的酒精沖洗兩次,無水乙醇洗一次,室溫下晾干,加入50μLTE溶液溶解。-20℃保存,備用。(3)玻璃粉法:為本實驗室的藻類DNA提取方法,通過CTAB提取緩沖液裂解釋放出DNA,再用凝膠純化試劑盒純化DNA。具體操作見文獻(xiàn)。(4)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法:將高鹽法的SDS提取緩沖液換成4×CTAB提取緩沖液(4%CTAB,0.1mol/LTris-HClpH值8.0,0.02mol/LEDTApH值8.0,1.4mol/LNaCl),提取過程與高鹽法相同。1.3pcr反應(yīng)體系及條件以psbA基因的PCR擴(kuò)增效果對4種DNA提取方法進(jìn)行檢測,psbA基因的PCR擴(kuò)增引物見文獻(xiàn)。4種DNA提取方法獲得的DNA都以50μLTE溶液溶解,實驗時稀釋10倍。PCR反應(yīng)在UNOⅡBiometra儀上進(jìn)行,25μL反應(yīng)體系中含10×PCRBuffer[0.2mol/L(NH4)2SO4,0.75mol/LTris-HClpH值8.8,0.1%Tween20](MBI)2.5μL,25mmol/LMgCl2(MBI)2.5μL,dNTP(Takara)2μL,引物為1.0μmol/L,DMSO(北京鼎國生物有限公司)4μL,TaqDNApolymerase(MBI)1U,1μL模板(1∶10)DNA,其它用滅菌蒸餾水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為,94℃變性5min;然后35個循環(huán),每個循環(huán)為,94℃30s,55℃45s,72℃1min30s,最后72℃延伸10min。1.4檢測dna基因組DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳,100V電壓電泳,溴化乙錠(EB)染色,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。2結(jié)果2.1不同方法提取的基因組dna條帶4種DNA提取方法對球形棕囊藻和綠色巴夫藻基因組DNA提取結(jié)果如圖1,由圖可以看出,高鹽法和PVP法對兩種藻的提取效果相當(dāng),在大約20Kb處都有一條清晰的基因組DNA帶,同時在點樣孔內(nèi)也殘留著大量的DNA,拖尾現(xiàn)象也較明顯,由此可見,這兩種方法提取的DNA雖然產(chǎn)量高,但雜質(zhì)含量也較多。玻璃粉法和CTAB法提取的基因組DNA條帶較前兩種方法的弱,但點樣孔內(nèi)殘留的DNA少,且拖尾現(xiàn)象也不明顯,因此,后兩種DNA提取方法較前兩種方法提取的DNA產(chǎn)量低,但雜質(zhì)含量少,純度高,玻璃粉法效果尤為明顯,基因組帶只在20Kb處有一亮帶。從藻種而言,后兩種DNA提取方法存在一定的差異性,總體以球形棕囊藻的提取效果好于綠色巴夫藻。2.2psba基因的pcr擴(kuò)增效果psbA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2,由圖可以看出,4種DNA提取方法提取的DNA對綠色巴夫藻psbA基因的PCR擴(kuò)增都有較好的擴(kuò)增效果,在靠近1Kb處都有一條清晰的特異性擴(kuò)增條帶,且不同方法間差異不明顯。但是,對球形棕囊藻而言,不同方法間差異較大,其中以改良CTAB法提取DNA的PCR擴(kuò)增效果最好,其次為高鹽法和CTAB法,PVP法提取的DNA沒有發(fā)現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。3分析與討論3.1dna分離方法的比較球形棕囊藻和綠色巴夫藻雖然都是金藻門藻類,但是兩者的結(jié)構(gòu)組成和營養(yǎng)生理卻差別較大,它們是金藻門群體和單細(xì)胞藻類的典型代表。棕囊藻生活史復(fù)雜,地理差異明顯,有單細(xì)胞和群體兩種形態(tài),并且單細(xì)胞又分為游動細(xì)胞和不動細(xì)胞,最主要的是群體內(nèi)每個細(xì)胞都能產(chǎn)生光合碳,并最終合成粘質(zhì)多糖,整個群體多糖含量高,并且在條件惡劣的情況下還能產(chǎn)生溶血素等有毒物質(zhì),因此,棕囊藻除了多糖含量高外,其它次生物質(zhì)含量也較豐富。然而,綠色巴夫藻是一種單細(xì)胞微小金藻,藻細(xì)胞無細(xì)胞壁,能運動,不飽和脂肪酸含量高。球形棕囊藻和綠色巴夫藻生物學(xué)特性上的差異性必定會導(dǎo)致兩者在DNA提取上的差異性。在DNA提取結(jié)果中,尤其是在玻璃粉法和CTAB法兩種方法中,球形棕囊藻明顯好于綠色巴夫藻。SDS和CTAB兩種提取緩沖液在裂解細(xì)胞、釋放DNA的原理和效果上,本身存在明顯的差異。SDS主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合,使蛋白質(zhì)變性,破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞基因組DNA釋放出來,并且在高鹽濃度下將DNA和蛋白質(zhì)分離;CTAB能有效的裂解植物的細(xì)胞壁,但是對破壞細(xì)胞膜效果差,所以一般情況下必須與能使蛋白質(zhì)變性,破壞細(xì)胞膜的蛋白酶K或酚-氯仿結(jié)合使用,然而,它的優(yōu)勢是CTAB在高鹽濃度(>0.7mol/LNaCl)的情況下與DNA結(jié)合,從而使DNA與非DNA物質(zhì),如多糖物質(zhì)、酚類物質(zhì)等次生物質(zhì)分離開來,因而獲得的DNA較純。因此,SDS提取緩沖液通常對不含細(xì)胞壁或次生物質(zhì)含量較少的細(xì)胞裂解效果較好;而CTAB則對含細(xì)胞壁和多糖類細(xì)胞裂解效果佳。從DNA提取實驗結(jié)果可以清楚的看到,以SDS提取緩沖液作為裂解液的方法,如高鹽法和PVP法,提取的DNA總量都比以CTAB緩沖液作為裂解液的方法(CTAB法和玻璃粉法)高,但是以CTAB緩沖液作為裂解液的方法提取的DNA較純;比較高鹽法和CTAB法可以發(fā)現(xiàn),雖然兩者都是利用高鹽(6mol/LNaCl)來分離DNA,但前者用的是SDS提取緩沖液,而后者用的是CTAB提取緩沖液,最后高鹽法對兩種藻提取的基因組DNA的量明顯高于CTAB法;比較同以CTAB緩沖液作為裂解液的玻璃粉法和CTAB法兩種方法可以看出,CTAB法由于只使用了蛋白酶K輔助裂解細(xì)胞,而玻璃粉法除了使用蛋白酶K外還使用了酚-氯仿抽提,最后玻璃粉法提取基因組DNA的量明顯高于CTAB法。由此可見,SDS提取緩沖液對兩種藻的裂解能力明顯強(qiáng)于CTAB提取緩沖液,并且CTAB提取緩沖液與蛋白酶K和酚-氯仿結(jié)合使用效果較好。以SDS提取緩沖液作為細(xì)胞裂解液的高鹽法和PVP法的最大優(yōu)點就是在整個實驗中都避免了與有毒物質(zhì)的接觸,操作安全、簡單。高鹽法采用的是6mol/LNaCl飽和溶液,而PVP法用的是10%的PVPk30和7.5mol/LNH3Ac,原理都是利用高鹽濃度沉淀去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì),從而分離出DNA。PVP法除了使用類似于高鹽法中的NaCl飽和溶液的NH3Ac飽和溶液,還多加了一種高分子化合物PVP,PVP是一種高分子合成樹脂,可溶于水、乙醇及氯仿,工業(yè)上常用作澄清劑、穩(wěn)定劑,能絡(luò)合多酚類物質(zhì),防止多酚物質(zhì)氧化成醌類,具有抗氧化作用。從DNA提取結(jié)果來看,兩種方法對兩種藻類DNA的提取效果差別不明顯,但從PCR反應(yīng)來看,高鹽法效果更好。可見,在分離DNA的時候用同為單價離子的弱酸弱堿鹽代替強(qiáng)堿強(qiáng)酸鹽,并加入澄清劑PVP來提高DNA純度的效果不大。玻璃粉法以CTAB緩沖液作為提取液,通過蛋白酶K和酚-氯仿來提高對藻細(xì)胞的裂解,促進(jìn)DNA的釋放,利用玻璃粉結(jié)合DNA的方法來分離純化DNA,取得了顯著的效果。玻璃粉法對兩種藻類提取的DNA量比CTAB法有明顯的增加,并且純度在4種方法中也是最高的。就不同藻類DNA的提取效果來看,以球形棕囊藻效果最好,無論在純度還是量上都取得了成功。由此可見,玻璃粉法對于糖類和膠質(zhì)等次生物質(zhì)含量較多的棕囊藻DNA提取是非常有效的。3.2pcr擴(kuò)增和dna提取方法的影響從psbA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果可以看出,對于綠色巴夫藻,不同DNA提取方法獲得的DNA對psbA基因都有較好的特異性擴(kuò)增。對于球形棕囊藻,則以玻璃粉法提取的DNA對psbA基因的PCR擴(kuò)增效果最好,其次為高鹽法,CTAB法提取的DNA只有微量的擴(kuò)增,PVP法則未見有擴(kuò)增條帶。這可能與DNA的濃度和純度有關(guān),棕囊藻由于多糖等次生物質(zhì)較多,并且SDS雖然裂解能力較強(qiáng),但是對多糖等去除效果較差,實驗過程中也發(fā)現(xiàn),用TE溶液溶解的DNA溶液粘度較大,可見其糖類物質(zhì)含量較高,這可能直接影響到了PCR的擴(kuò)增效果。然而,綠色巴夫藻由于無細(xì)胞壁,多糖類物質(zhì)含量也較少,因此,其提取DNA的PCR擴(kuò)增效果較好。至